毒害艾美耳球蟲河南分離株早熟系選育及生物學(xué)特性研究

董 青

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院 ， 河南 鄭州 450011)

雞球蟲病是由一種或幾種雞艾美耳球蟲引起的以腸道病變?yōu)橹饕卣鞯摹⑽：O為嚴(yán)重的全球性寄生蟲病[1]。目前，本病的防治主要依賴藥物，但是隨著藥物的廣泛使用，抗球蟲藥藥物殘留問題和對(duì)生態(tài)環(huán)境的污染日趨嚴(yán)重，因此，疫苗免疫將成為預(yù)防球蟲病的主流[2-3]。現(xiàn)有研究認(rèn)為，雞發(fā)生球蟲病后可獲得針對(duì)同種球蟲的較強(qiáng)的免疫力，這也正是雞球蟲病活卵囊疫苗研究的基本原理。球蟲的自然分離株感染雞后均會(huì)不同程度地對(duì)雞的生長(zhǎng)性能產(chǎn)生影響，而具有良好免疫原性的減毒株可以克服這一缺點(diǎn)。目前，雞球蟲的致弱方法包括早熟選育、雞胚適應(yīng)及輻射致弱等，但其中早熟選育被認(rèn)為是最成功的，且獲得的早熟系在遺傳上也相對(duì)最為穩(wěn)定[4-6]。此技術(shù)在國(guó)內(nèi)外被先后采用，英國(guó)Houghton Lab研制出由柔嫩艾美耳球蟲(Eimerianecatrix,E.tenella)、堆型艾美耳球蟲(E.acervulina)、 和緩艾美耳球蟲(E.mitis)、早熟艾美耳球蟲(E.praecox)、巨型艾美耳球蟲(E.maxima)、布氏艾美耳球蟲(E.brunetti)和毒害艾美耳球蟲(E.necatrix)共7種早熟致弱蟲株組成的球蟲苗Paracox，該球蟲苗在英國(guó)、荷蘭和愛爾蘭等國(guó)家投入市場(chǎng)使用，對(duì)防治雞球蟲病發(fā)揮了積極的作用[7-9]。

球蟲在免疫保護(hù)力上存在著蟲株差異，因此有必要對(duì)不同的蟲株進(jìn)行早熟選育。本試驗(yàn)對(duì)河南地區(qū)純種E.necatrix進(jìn)行早熟選育，選育成功后對(duì)E.necatrix早熟減毒株與母株的基本生物學(xué)特性進(jìn)行比較研究，為早熟減毒株的早熟機(jī)理、早熟減毒株疫苗研制和研究雞球蟲病球蟲種間和株間的分子生物學(xué)差異提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 剛出殼后的1日齡SPF雞放入專用雞盒運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，在進(jìn)行嚴(yán)格消毒的無球蟲的育雛室內(nèi)飼養(yǎng)至2～4周齡；禽舍的最初溫度控制在30～35 ℃，每周遞減2 ℃，直至室溫，濕度控制在55%～65%；24 h光照；飼喂經(jīng)高壓滅菌的、無任何藥物添加的SPF雞全價(jià)育雛顆粒飼料；飲水引自天然泉水，采用純凈水設(shè)備經(jīng)過三重反滲透凈化處理，且加入紫外線和臭氧消毒，確保飲水無球蟲。

1.2 蟲株E.necatrix純種蟲株分離自河南省洛陽市某雞場(chǎng)，分離、鑒定、純化后保存，試驗(yàn)前經(jīng)雞體傳代復(fù)壯。

1.3 早熟減毒株選育和潛隱期的研究 參照J(rèn)effers等[7]建立的艾美耳屬球蟲早熟系選育法，將E.necatrix蟲株孢子化卵囊用水離心洗滌(轉(zhuǎn)速為3 000 r/min，時(shí)間為10 min)3～5次，以5×104個(gè)/羽的劑量經(jīng)口接種SPF雛雞，接種卵囊后的第4天起，收集雛雞的新鮮糞便(1 次/h)，光學(xué)顯微鏡檢測(cè)有無卵囊。第1次檢測(cè)到卵囊的時(shí)間為潛隱期，收集卵囊進(jìn)行孢子化培養(yǎng)，培養(yǎng)后的卵囊，以5×104個(gè)/羽 的劑量再次經(jīng)口接種SPF雛雞，直到潛隱期時(shí)間縮短，并至少連續(xù)3代穩(wěn)定。

1.4 形態(tài)學(xué)研究 在光學(xué)顯微鏡下對(duì)選取的第30代E.necatrix早熟減毒株和母株各30個(gè)孢子化大小進(jìn)行測(cè)量長(zhǎng)、寬，并計(jì)算其形狀指數(shù)和大小。

1.5 致病性研究 將3日齡SPF雞隨機(jī)分為8組，每組10只，隔離飼養(yǎng)，其中第1組為空白對(duì)照組，第2～4組 試驗(yàn)雞經(jīng)口灌服E.necatrix母株卵囊，劑量分別為1.0×104、5.0×104個(gè)/羽和10.0×104個(gè)/羽；第5～8組接種E.necatrix早熟減毒株卵囊，劑量分別為1.0×104、5.0×104、10.0×104個(gè)/羽和15.0×104個(gè)/羽。 期間觀察試驗(yàn)雞的死亡、寄生部位、對(duì)雞的致病性，計(jì)算相對(duì)增重情況，并進(jìn)行毒害艾美耳球蟲病變記分[10]。

1.6 免疫原性研究 3日齡SPF雞隨機(jī)分為11組，每組10只，隔離飼養(yǎng)，其中第1組為空白對(duì)照組，不攻蟲不免疫；第2組和第7組為攻蟲對(duì)照組，只攻蟲不免疫；第3～6組分別經(jīng)口灌服免疫不同劑量的E.necatrix母株孢子化卵囊，劑量分別為200、500、1 000個(gè)/羽 和2 000個(gè)/羽，第8～11組接種E.necatrix早熟減毒株孢子化卵囊，劑量分別與母株相同。免疫后21 d各免疫組和攻蟲對(duì)照組感染同種E.necatrix母株孢子化卵囊，劑量為5.0×104個(gè)/羽；攻蟲感染后7 d 處死全部試驗(yàn)雞，以死亡、相對(duì)增重及小腸病變?cè)u(píng)價(jià)E.necatrix母株和早熟減毒株免疫原性。

3日齡SPF雞隨機(jī)分為4組，每組10只，隔離飼養(yǎng)，其中第1組為空白對(duì)照組，不攻蟲不免疫；第2組為攻蟲對(duì)照組，只攻蟲不免疫；第3組口服500個(gè)/羽 劑量的E.necatrix母株孢子化卵囊；第4組 口服500個(gè)/羽劑量的E.necatri早熟減毒株孢子化卵囊。除第1組外，第2～4組3 d后感染同種E.necatrix母株孢子化卵囊，劑量為5.0×104個(gè)/羽；并每天分別收集各組所有糞便，稱重，進(jìn)行每克糞便中卵囊記數(shù)，用麥克馬斯特板計(jì)數(shù)法計(jì)算每克糞便卵囊數(shù)(OPG)，直到糞便中無球蟲卵囊為止，計(jì)算排卵囊期內(nèi)各組中每羽雞排卵囊總量。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì) 所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 20.0 軟件中單因素方差分析(One-way ANVOA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P≤0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著，均值采用Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 早熟系選育 經(jīng)過連續(xù)30代的早熟選育后，E.necatrix早熟減毒株的潛隱期縮短了23 h，由母株的144 h縮短至121 h，并且連續(xù)3代的潛隱期穩(wěn)定在121 h，達(dá)到選育目標(biāo)，各代次蟲株均寄生于雞體小腸中段。

2.2 形態(tài)學(xué)研究 經(jīng)10×40倍顯微鏡觀察顯示，第30代E.necatrix早熟減毒株和母株的孢子化卵囊各30個(gè)，結(jié)果見表1。從表1可知，E.necatrix早熟減毒株卵囊的長(zhǎng)、寬以及大小均比母株的小，但差異不顯著(P>0.05)；早熟減毒株(1.24)的卵囊指數(shù)比母株(1.21)的稍大或者相等。

表1 30個(gè)隨意挑選出的E. necatrix早熟減毒株和母株孢子化卵囊各度量值之間的對(duì)比Table 1 Comparison of the size of 30 haphazardly selected parent and precocious attenuated strain of E. necatrix

2.3 致病性研究 3日齡試驗(yàn)雞在感染1.0×104個(gè)E.necatrix母株孢子化卵囊劑量(第2組)時(shí)，病變記分均1～2分，而感染同劑量的E.necatrix早熟減毒株孢子化卵囊(第5組)時(shí)，試驗(yàn)雞無球蟲臨床癥狀，病變記分均≤+1分，母株和早熟減毒株組均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；感染5.0×104個(gè)E.necatrix母株孢子化卵囊劑量以上(第3組)時(shí)均不同程度的表現(xiàn)出食欲不振、精神委頓、羽毛逆立、縮脖呆立、扎堆、排血便的癥狀，且相對(duì)增重率明顯降低，小腸病變記分均≥+3分，試驗(yàn)雞有10%的死亡，相對(duì)增重率為92.25%，而感染同劑量的E.necatrix早熟減毒株孢子化卵囊(第6組)時(shí)，試驗(yàn)雞小腸病變記分為1～2分，存活率100%，相對(duì)增重率為95.53%；感染10.0×104個(gè)母株孢子化卵囊劑量(第4組)的試驗(yàn)雞有40%的死亡，且相對(duì)增重率明顯降低，為85.32%，雞病變記分為3～4分，而感染同劑量的E.necatrix早熟減毒株組(第7組)毒力明顯減弱，試驗(yàn)雞小腸病變記分為2～3分，存活率仍為100%，相對(duì)增重率為93.42%；直至感染15.0×104個(gè)E.necatrix早熟減毒株孢子化卵囊(第8組)時(shí)，試驗(yàn)雞有10%的死亡。感染E.necatrix早熟減毒與母株各劑量組試驗(yàn)雞，剖檢后顯示均寄生于雞體小腸中段。結(jié)果見表2。

表2 E.necatrix母株以及早熟減毒株孢子化卵囊對(duì)雞的致病性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Virulence test results of parent and precocious attenuated strain of E.necatrix

用E.necatrix母株單卵囊后代感染10只雞(5.0×104個(gè)/羽)，結(jié)果接種后第4、5天試驗(yàn)雞開始出現(xiàn)臨床褐色血便，第5天處死全部試驗(yàn)雞后，剖檢可見典型的小腸病變，小腸腔內(nèi)有大量出血，漿膜面有紅色或白色斑點(diǎn)。消化道其他部位沒有雞球蟲病的病變(中插彩版圖1)。

圖1 E.necatrix母株感染雞病變Fig.1 Lesions in chickens after infection by parent strain of E.necatrixA：黏膜層； B：漿膜層A：Mucous layer； B：Serosa layer

用E.necatrix早熟減毒株單卵囊后代感染10只雞(5.0×104個(gè)/羽)，結(jié)果接種后發(fā)現(xiàn)其毒力較母株卵囊明顯減弱(P<0.05)，試驗(yàn)雞小腸病變記分≤+2分(中插彩版圖2)。

圖2 E.necatrix早熟減毒株感染雞病變Fig.2 Lesions in chickens after infection by precocious attenuated strain of E.necatrixA：B：漿膜層； 黏膜層A：B：Serosa layer； Mucous layer

2.4 免疫原性研究 所有空白組的試驗(yàn)雞均健康存活，腸道無病變(第1組)；攻蟲對(duì)照組(第2組和第7組)存活率均為90%，所有試驗(yàn)雞的小腸病變記分均≥+3分；免疫攻蟲組(第3～6組和第8～11組)各試驗(yàn)雞均健康存活，各劑量組試驗(yàn)雞的腸道病變記分均≤+1分，200個(gè)/羽劑量的E.necatr免疫組即能產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)力，說明E.necatrix母株和早熟減毒株均具有良好的免疫原性。結(jié)果見表3。

表3 E.necatrix母株以及早熟減毒株免疫原性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Immunogenicity test results of parent and precocious attenuated strain of E.necatrix

感染后第2天開始收集雞糞，10只雞糞混勻，按麥克馬斯特板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，7～10 d雞糞中OPG最高，排卵囊期內(nèi)各組中每羽雞排卵囊總量結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，第1組未檢測(cè)出E.necatrix卵囊，第3組和第4組及攻蟲對(duì)照組均檢測(cè)出球蟲卵囊，且第1組與其他組差異性顯著(P<0.05)；第3組(母株免疫組)排卵囊高峰期在接種后的第9天，第7～9天每羽雞排卵囊總量分別為135×104、687×104個(gè)/羽和799×104個(gè)/羽；第4組(早熟減毒株免疫組)排卵囊高峰期在接種后的第8天，較母株提前了1 d，第7～9天每羽雞排卵囊總量分別為486×104、623×104個(gè)/羽和110×104個(gè)/羽；兩組免疫組極顯著低于攻蟲對(duì)照組(P<0.01)。說明免疫組均產(chǎn)生免疫作用，抑制了球蟲卵囊的繁殖。

表4 接種后7～10 d的排卵囊總量 (×104個(gè)/羽)Table 4 Total amaunt of ovulatory sac 7-10 days after inoculation

3 討論

3.1 早熟減毒株選育 球蟲具有地區(qū)適應(yīng)性，所以，本地區(qū)選育出的球蟲早熟致弱蟲株只能用于本地區(qū)的免疫預(yù)防，用在其他地區(qū)時(shí)，常未達(dá)到理想效果。本試驗(yàn)經(jīng)過連續(xù)30代的早熟選育后，E.necatrix潛隱期縮短了23 h，并且連續(xù)3代傳代潛隱期穩(wěn)定。經(jīng)研究表明，早熟減毒株潛隱期縮短的原因是其裂殖體發(fā)育快，裂殖生殖不完全，提前進(jìn)入配子生殖[8-9]。要證明本試驗(yàn)所選育的早熟減毒株潛隱期縮短、發(fā)育加快的可能原因，以及所選育的早熟減毒株是否具有基因突變，還需做進(jìn)一步的內(nèi)生性發(fā)育以及遺傳穩(wěn)定性的研究。

3.2 卵囊大小測(cè)量 本試驗(yàn)經(jīng)過連續(xù)30代早熟選育得到的E.necatrix早熟減毒株，E.necatrix早熟減毒株的孢子化卵囊大小為20.50 μm×16.55 μm，相對(duì)應(yīng)的母株大小為21.50 μm×18.00 μm，早熟減毒株比母株略小。韓靜芳等[6]和張志敏等[11]的研究結(jié)果表明，球蟲卵囊的大小可能與其潛隱期及致病性有關(guān)系。造成早熟減毒株卵囊大小相對(duì)于母株偏小的原因可能是由于潛隱期縮短，最后一代裂殖體發(fā)育快，裂殖生殖不完全，提前進(jìn)入配子生殖影響到蟲體在體內(nèi)的發(fā)育。

3.3 毒力及致病性測(cè)定 本試驗(yàn)的毒力性試驗(yàn)可以看出，雞感染E.necatrix早熟減毒株時(shí)3個(gè)劑量組(1×104、5×104個(gè)/羽和10×104個(gè)/羽)死亡率分別為0、0、0，而母株在感染同劑量時(shí)死亡率分別為0、10%、40%；3日齡試驗(yàn)雞在感染1.0×104個(gè)E.necatrix母株孢子化卵囊劑量時(shí)，病變記分均1～2分，而感染同劑量的E.necatrix早熟減毒株孢子化卵囊時(shí)，試驗(yàn)雞無球蟲臨床癥狀，病變記分均≤1分。這些指標(biāo)表明，E.necatrix早熟減毒株的致病性明顯低于母株。這與之前劉群等研究早熟柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)的結(jié)果相似。劉群等[12]對(duì)E.tenella的研究結(jié)果顯示，感染0.1×104個(gè)/羽母株卵囊的致病力相當(dāng)于感染10×104個(gè)/羽早熟減毒株卵囊的致病力。導(dǎo)致早熟減毒株毒力減弱的可能原因：在球蟲生活史當(dāng)中，最后一代裂殖生殖階段是致病性最強(qiáng)的階段，由于早熟減毒株裂殖體發(fā)育快，裂殖生殖不完全，提前進(jìn)入配子生殖，導(dǎo)致了早熟減毒株繁殖力有所減弱。由于早熟減毒株裂殖體變小所以對(duì)雞腸道組織的損傷減輕，只有在超高劑量的早熟減毒株感染時(shí)才會(huì)產(chǎn)生血便，但血便量不僅少而且持續(xù)時(shí)間短，所以早熟減毒株致病性降低，臨床癥狀不明顯，可作為球蟲疫苗的候選蟲株。

3.4 免疫原性測(cè)定 球蟲感染宿主后可在體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)。自然感染球蟲中，球蟲生活史早期的無性階段是誘導(dǎo)保護(hù)性免疫的最重要的階段[13]。E.necatrix早熟減毒株在球蟲發(fā)育史中缺失了1或2代裂殖生殖，因而不影響其免疫原性。本試驗(yàn)的免疫原性試驗(yàn)可以看出，200個(gè)/羽劑量的E.necatrix早熟減毒株和母株即能產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)力，免疫組增重和病變記分與母株的相當(dāng)，說明E.necatrix早熟減毒株保持了母株良好的免疫原性。這與Davies、Hein、Shirley等、Montes等得出的早熟減毒株的免疫原性與母株相比較無明顯變化結(jié)果一致[14-17]。但李建梅等、Chapman等認(rèn)為毒害艾美耳球蟲的免疫原性在雞的7種球蟲中最弱，并說明雞球蟲的免疫研究中，不同種球蟲的抗原存在差異，同種不同株間的抗原也存在差異，同一個(gè)體的不同發(fā)育階段抗原也不盡相同[18-19]。

本試驗(yàn)獲得了河南省E.necatrix早熟減毒株，發(fā)現(xiàn)其具有潛在期明顯縮短、致病性較母株弱、保持了母株免疫原性等球蟲早熟減毒株的獨(dú)特特點(diǎn)，為河南省雞球蟲活卵囊疫苗的研制提供了科學(xué)依據(jù)。