非小細胞肺癌組織長鏈非編碼RNA LINC00265、microRNA-98-5p的表達及其臨床意義*

張帆，劉威，龍永貴，趙飛，劉凌曦，胡同晨，彭華利，馬智群

（樂山市人民醫院胸心外科，四川樂山614000）

肺癌是最常見的腫瘤，其中多數患者為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC），NSCLC 病死率高，危及患者生命安全[1-2]。目前，學者認為NSCLC 發病與環境惡化、不良生活習慣、microRNA（miRNA）及長鏈非編碼 RNA（long noncoding RNA, lncRNA）異常表達、免疫逃逸、炎癥反應、自噬等關系密切[3]，且lncRNA、miRNA 可相互調控，共同參與NSCLC 的發生、發展[4]。有研究發現，lncRNA LINC00265 在急性髓細胞性白血病（acute myelogenous leukemia, AML）患者中表達上調，其可能通過影響自噬進而抑制癌細胞凋亡，從而在AML 中發揮調控作用[5]；而microRNA-98-5p（miR-98-5p）在NSCLC 中呈低表達，其可能抑制NSCLC 細胞的增殖及轉移，且可能是治療NSCLC的潛在靶標[6]。但lncRNA LINC00265 在NSCLC 患者中的表達及與miR-98-5p、預后的關系鮮有報道。因此本研究通過測定NSCLC 患者lncRNA LINC00265、miR-98-5p 相對表達量，分析兩者的相關性及與預后的關系，以期為NSCLC 的防治提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2016年1月—2017年12月在樂山市人民醫院行根治性切除術的原發性NSCLC 患者97 例作為研究對象。其中，男性56 例，女性41 例；年齡45～72 歲，平均（59.03±10.27）歲；年齡＜60 歲35 例，≥60 歲62 例；淋巴結轉移52 例，淋巴結未轉移45 例；腫瘤≤3 cm 43 例，腫瘤＞3 cm 54 例；臨床分期Ⅰ期30 例，Ⅱ、Ⅲ期67 例；腺癌40 例，鱗癌43 例，其他病理類型14 例；低分化41 例，中、高分化56 例；肺葉切除89 例，單側全肺切除8 例。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，所有受試對象及家屬簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準①符合NSCLC 診斷標準，經病理學確診為NSCLC[7]；②術前無放化療者。

1.2.2 排除標準①臨床資料不完整；②合并嚴重臟器疾病、其他惡性腫瘤；③存在手術禁忌證。

1.3 主要試劑及儀器

利用Trizol 試劑（SBJ-L0055，南京森貝伽生物科技有限公司），miRNA 提取試劑盒（R6842-02，北京智杰方遠科技有限公司），First Strand cDNA Synthesis Kit（TER016-1，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司），miScript Reverse Transcription Kit（218060，美國Thermo Fisher 公司），TaqMan?Universal Master Mix（4444558，上海恪敏生物科技有限公司），實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）儀（StepOneTM，美國ABI 公司）。

1.4 樣本收集

收集NSCLC 患者術中切除的癌組織標本和癌旁正常組織標本（距癌組織＞3 cm），置于液氮罐中凍存24 h 后移至-70℃冷凍保存。

1.5 qRT-PCR 檢測組織lncRNA LINC00265、miR-98-5p相對表達量

解凍凍存組織標本，利用Trizol 試劑/miRNA 提取試劑盒抽提總RNA，First Strand cDNA Synthesis Kit/miScript Reverse Transcription Kit 合成cDNA。采用TaqMan?Universal Master Mix 及qRT-PCR 儀對cDNA 進行擴增、檢測。反應條件：94℃預變性4 min；93℃變性15 s，64℃退火30 s，共計40 個循環。 lncRNA LINC00265、miR-98-5p 分別以GAPDH、U6 為內參，引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法計算lncRNA LINC00265、miR-98-5p 相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.6 生物信息學軟件預測lncRNA LINC00265 與miR-98-5p的關系

利用生物信息學網站（http：//starbase.sysu.edu.cn/agoClipRNA.php?source=lncRNA＆flag=target＆clade=mammal＆genome=human＆assembly=hg19＆miRNA=all＆clipNum=1＆deNum=0＆panNum=0＆target=LINC00265）對lncRNA LINC00265 與miR-98-5p 的關系進行預測分析。

1.7 隨訪

對97 例NSCLC 患者進行隨訪，以手術當日為隨訪起點，電話/門診為主要隨訪方式，2020年12月31日或患者死亡為隨訪終點，記錄患者術后情況，計算術后總生存時間（overall survival, OS）、無病生存期（disease-free survival,DFS）。

1.8 統計學方法

數據分析采用SPSS 25.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗；相關性分析用Pearson 法；Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，影響因素的分析用Cox 回歸模型。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 癌旁正常組織與癌組織lncRNA LINC00265、miR-98-5p相對表達量比較

NSCLC 患者癌旁正常組織與癌組織lncRNA LINC00265、miR-98-5p 相對表達量比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），癌組織lncRNA LINC00265 相對表達量高于癌旁正常組織，miR-98-5p 相對表達量低于癌旁正常組織。見表2。

表2 癌旁正常組織與癌組織lncRNA LINC00265、miR-98-5p相對表達量比較 （n=97，±s）

表2 癌旁正常組織與癌組織lncRNA LINC00265、miR-98-5p相對表達量比較 （n=97，±s）

組別lncRNA LINC00265 miR-98-5p癌旁正常組織癌組織t 值P 值1.05±0.35 1.86±0.62 11.205 0.000 1.03±0.34 0.50±0.17 13.732 0.000

2.2 癌組織lncRNA LINC00265、miR-98-5p 表達水平與NSCLC患者臨床病理特征關系

以lncRNA LINC00265 相對表達量平均值1.86為界限，分為低表達（47 例）和高表達患者（50 例）。以miR-98-5p 相對表達量平均值0.50 為界限，分為低表達（49 例）和高表達患者（48 例）。不同性別、年齡、腫瘤大小、病理類型、手術方式患者癌組織的lncRNA LINC00265 和miR-98-5p 表達水平比較，經χ2檢驗，差異無統計學意義（P＞0.05）；而有無淋巴結轉移、不同臨床分期和低分化患者癌組織的lncRNA LINC00265 和miR-98-5p 表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 不同臨床病理特征患者lncRNA LINC00265、miR-98-5p表達水平比較 例

2.3 癌組織lncRNA LINC00265 與miR-98-5p 的相關性

Pearson 法結果顯示，NSCLC 患者癌組織lncRNA LINC00265與miR-98-5p呈負相關（r=-0.580，P=0.000）（見圖1）。生物信息學分析顯示，lncRNA LINC00265 與miR-98-5p 存在靶向結合位點，兩者可能存在靶向調控關系（見圖2）。

圖1 NSCLC患者癌組織lncRNA LINC00265與miR-98-5p的相關性

圖2 lncRNA LINC00265與miR-98-5p存在靶向結合位點

2.4 癌組織lncRNA LINC00265、miR-98-5p 表達水平與NSCLC患者預后的關系

97 例NSCLC 患者隨訪36 個月，其中生存52 例，無病生存49 例。Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，結果顯示，NSCLC 患者lncRNA LINC00265 高表達患者OS為25.44個月（95%CI：22.45，28.43），DFS為22.88個月（95%CI：19.81，25.95）；lncRNA LINC00265 低表達患者OS 為31.62 個月（95% CI：29.22，34.01），DFS 為31.17 個月（95%CI：28.66，33.68）。lncRNA LINC00265高表達與低表達患者的總生存率、無病生存率比較，經χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=14.750 和17.552，P=0.000），lncRNA LINC00265高表達患者總生存率、無病生存率較低。見圖3、4。

圖3 NSCLC患者癌組織lncRNA LINC00265表達水平與OS的關系

圖4 NSCLC患者癌組織lncRNA LINC00265表達水平與DFS的關系

miR-98-5p高表達患者OS為31.27個月（95%CI：28.91，33.64），DFS 為30.56 個月（95% CI：28.07，33.06）；miR-98-5p 低表達患者OS 為25.65 個月（95% CI：22.57，28.73），DFS 為23.01 個月（95% CI：20.11，26.51）。miR-98-5p 高表達與低表達患者的總生存率、無病生存率比較，差異有統計學意義（χ2=11.017 和11.205，均P=0.001），miR-98-5p 高表達患者總生存率、無病生存率較高。見圖5、6。

圖5 NSCLC患者癌組織miR-98-5p表達水平與OS的關系

圖6 NSCLC患者癌組織miR-98-5p表達水平與DFS的關系

2.5 NSCLC患者預后因素的分析

表4 影響NSCLC患者預后的單因素Cox回歸分析參數

表5 影響NSCLC患者預后的多因素Cox回歸分析參數

3 討論

NSCLC 是發并率和死亡率較高的呼吸系統腫瘤，目前，手術仍是治療NSCLC 的重要手段，但因手術的創傷性及術后的高復發率，患者預后較差[8-9]。因此，尋找與NSCLC 發病相關，且可評估患者預后的指標，對及早干預，改善NSCLC 患者生存狀況有積極意義。

lncRNA 是一類長鏈非編碼RNA，其可調控炎癥反應、染色體重構、免疫應答、自噬、個體發育、細胞增殖/凋亡、氧化應激等過程，與慢性阻塞性肺疾病、肺癌等密切相關[10-11]。有研究顯示，lncRNA GABPB1-IT1 在NSCLC 中表達下調，其可能是治療NSCLC 的靶點及評估預后的標志物[12]；另外，lncRNA GAS5 在NSCLC 中過表達，其有望成為診治、評估NSCLC 預后的有效指標[13]。以上研究表明，NSCLC 病理變化可能與lncRNA 表達失調有關。有研究發現，lncRNA LINC00265 作為lncRNA 成員之一，在結直腸癌中表達升高，其可能通過調控有關靶基因的表達，促進結直腸癌的發生、發展[14]；另外，lncRNA LINC00265 在AML 患者骨髓及血清中過表達，其可能通過調節相關信號通路進而調節AML 細胞增殖、侵襲，具有診斷和評估AML 患者預后的潛在價值[15]。以上研究表明，lncRNA LINC00265 可能在多種腫瘤中發揮促癌作用。 本研究中NSCLC 患者癌組織lncRNA LINC00265 相對表達量高于癌旁正常組織，與其在AML 的趨勢一致[15]，且NSCLC 患者癌組織lncRNA LINC00265 表達水平與淋巴結轉移、臨床分期、分化程度有關，提示lncRNA LINC00265 與NSCLC 患者的臨床病理特征相關，其可能對NSCLC 的發生、發展起促進作用，推測lncRNA LINC00265 可能通過靶向結合相關基因，調節相關信號通路，促進NSCLC 細胞增殖、遷移，抑制癌細胞凋亡，從而影響NSCLC 的發生、發展，但具體機制有待深入研究。

miRNA 是機體一類非編碼小RNA 分子，其可調節生長發育、血管生成，影響自噬，調控細胞凋亡、分化、遷移、增殖，參與免疫炎癥，介導信號轉導過程[16-17]。有研究發現，miR-98-5p 作為miRNA 家族的一員，其可靶向結合α-1，3-甘露糖轉移酶進而抑制NSCLC 進展[18]；另外，miR-98-5p在NSCLC 中表達降低，其可能通過影響信號轉導過程進而在NSCLC 的發生、發展中發揮作用[19]。以上研究證實，miR-98-5p 可能作為抑癌因子，在NSCLC 病變過程中發揮抑癌作用。本研究顯示，NSCLC 患者癌組織miR-98-5p 相對表達量低于癌旁正常組織，與JIANG 等[6]研究結果一致，且癌組織miR-98-5p 表達水平與NSCLC 患者淋巴結轉移、臨床分期、分化程度有關，提示miR-98-5p 可能參與并影響NSCLC 病理變化，推測miR-98-5P 可能通過靶向結合有關基因，調節相關信號轉導，從而參與調控NSCLC 進展，其具體作用機制仍需進一步探討。

此外，生物信息學分析顯示，miR-98-5p可能是lncRNA LINC00265 的靶基因，且本研究中NSCLC 患者癌組織lncRNA LINC00265 表達水平與miR-98-5p 呈負相關，提示lncRNA LINC00265 可能與miR-98-5p 靶向結合，共同調控NSCLC 的發生、發展，但其機制有待深入研究證實。本研究結果顯示，lncRNA LINC00265 高表達、miR-98-5p 低表達患者36 個月OS 較低，提示lncRNA LINC00265、miR-98-5p 與NSCLC 患者預后相關，兩者有望成為評估NSCLC 患者預后的輔助指標。進一步研究發現，淋巴結轉移、臨床分期、lncRNA LINC00265是影響NSCLC 患者預后死亡的獨立危險因素，miR-98-5p 是影響NSCLC 患者預后死亡的獨立保護因素，提示臨床分期越高、淋巴結發生轉移、lncRNA LINC00265 表達水平升高、miR-98-5p 表達水平降低均會增加NSCLC 患者發生不良預后的風險，及時測定肺組織lncRNA LINC00265、miR-98-5p相對表達量有助于及早診治、評估NSCLC 患者預后。

綜上所述，NSCLC 患者癌組織lncRNA LINC00265 表達上調，miR-98-5p 表達下調，兩者呈負相關，均可能在NSCLC 發生、發展中起一定作用，且兩者可作為評估NSCLC 患者預后的標志物。本研究存在隨訪時間較短，樣本較少，且未深入探究lncRNA LINC00265、miR-98-5p 在NSCLC的作用機制，后期仍需進一步擴大樣本量、延長隨訪時間，結合基礎研究，為臨床診治NSCLC 提供新靶點增加說服力。