新生抗原癌癥疫苗研究進展

許銀銀，顧宙輝，錢 海*

1 中國藥科大學 藥物科學研究院，南京 211198；2 上海復星星泰醫藥科技有限公司，上海200120

癌癥疫苗利用腫瘤抗原誘導機體產生持久和特異性免疫應答。腫瘤抗原根據特異性又可分為腫瘤相關抗原和新生抗原[1，2]。腫瘤相關抗原是指在腫瘤細胞和正常細胞中都可能存在的抗原分子，因此容易引發中樞和外周耐受反應[3～6]，導致疫苗的接種效率變低，且有可能造成自身免疫性（autoimmunity）疾病。新生抗原是僅存在于癌細胞上的蛋白質片段，是腫瘤的特異性，在正常細胞中不表達，因此安全性高，能最大限度地降低不良反應和毒副作用，且新生抗原不會引發中樞耐受反應[7，8]。這些特性使新生抗原成為免疫療法中的有效靶標[9～12]。因此，開發靶向新生抗原的癌癥疫苗意義重大。本文對新生抗原癌癥疫苗的發展歷程、常見劑型、制備過程、遞送策略及臨床應用進行概述，以期為后續的研究提供參考。

1 發展歷程

新生抗原癌癥疫苗的研發歷時數十年，但是發展緩慢。1988 年，Plaen D 等利用cDNA 文庫篩選，在小鼠腫瘤模型中發現了第一個可被T 細胞識別的新生抗原；1991 年，van der Bruggen P 等用基因克隆技術發現人類第一個黑色素瘤特異性抗原MAGE-1；2015 年，Rose-nberg 團隊發現KRAS（其是一類鼠類肉瘤病毒癌基因,是人體最難攻克的致癌突變）突變也能產生新抗原；2017 年3 月，Khodadoust M 等發現人類B 淋巴瘤中存在豐富的MHC Ⅱ類新生抗原，抗原肽可與MHC Ⅱ新抗原結合形成MHC Ⅱ——抗原肽復合物，然后被免疫細胞識別以引發免疫反應；2017 年7 月，德國Loquai C 教授利用新抗原制備了RNA 疫苗，發現患者全部能產生免疫反應；哈佛大學Catherine J.Wu 教授制備了新抗原的肽疫苗，成功治愈了黑色素瘤；2020 年武漢華大吉諾因生產的靶向新抗原自身免疫T 細胞的注射液（NEO-T 注射液）獲國家藥監局臨床實驗許可。疫苗發展歷程見圖1。

圖1 新生抗原癌癥疫苗發展歷程

2 新生抗原制備的疫苗形式

新生抗原疫苗的主要劑型主要有四種：樹突狀細胞（DC細胞）疫苗、病毒載體疫苗、肽疫苗和核酸疫苗[13，14]。

2.1 DC 細胞疫苗

DC 細胞有兩種類型：未成熟DC 和成熟DC，在腫瘤抗原的刺激下，未成熟的DC 細胞會吸收抗原轉變為成熟的DC 細胞（見圖2）。成熟的DC 細胞的特征在于趨化因子受體（例如CCR7）、促炎細胞因子、共刺激分子（CD54，CD80 和CD86）、免疫蛋白體、MHC Ⅰ類和MHC Ⅱ類分子的上調，吞噬能力降低，抗原加工和呈遞能力增強，向淋巴組織遷移能力增強，刺激B 和T 細胞能力的增加，從而引發免疫反應，更好地發揮抗腫瘤的作用。新抗原DC 疫苗以誘導和增強DC 細胞的這種強免疫特性為出發點，旨在通過激活機體的免疫反應達到殺死腫瘤的目的。

圖2 DC 細胞抗腫瘤機制

新生抗原DC 疫苗制備思路：①新生抗原篩選；②體外分離、純化DC 細胞；③新生抗原刺激DC 細胞；④未成熟的DC 細胞轉變為成熟的DC 細胞；⑤成熟的DC 細胞回輸到患者體內。新生抗原DC 疫苗能夠安全有效地誘導腫瘤細胞介導的免疫反應，能明顯地改善患者的總體存活率[15]。德國Frank Gansauge 的團隊制備了LANEX-DC 疫苗，已有治愈肺癌、膠質瘤患者的實例。但是，DC 細胞疫苗的發展也面臨一些障礙：首先，DC 細胞在血液中存在濃度較低，所以DC細胞的分離與純化存在困難；其次，DC 細胞對培養基極為敏感，培養的DC 細胞存在較大的差異性。

2.2 病毒載體疫苗

病毒樣顆粒（Virus-like particle，VLP）因具有與天然病毒相似的結構（見圖3、圖4）而具有抗原性，因缺乏遺傳物質而不具有感染性；因此可有效交聯B 細胞上的特異性受體，即使在沒有佐劑的情況下也能有效誘導B 細胞介導的免疫反應；還可以觸發T 細胞介導的免疫反應，以刺激免疫應答增強疫苗功效[16]。腺病毒是最常用的病毒疫苗載體。目前腺病毒使用較多的為E1 或E3 基因缺失的第一代腺病毒。

圖3 病毒的結構

圖4 病毒樣顆粒的結構

病毒載體疫苗的制備：①新生抗原篩選；②病毒載體的制備；③新生抗原使用佐劑加載到病毒樣顆粒內部；④病毒載體疫苗回輸到體內。由于病毒載體疫苗缺乏靶向性且易被吞噬清除，大大限制了病毒載體疫苗的發展。目前，研究較多的針對新型冠狀病毒的重組病毒載體疫苗，它是以病毒作為載體，將抗原基因重組到病毒基因組中，借助病毒將抗原導入到人體內。在Ⅰ期/Ⅱ期臨床實驗中，中國研制的非復制型5 型腺病毒（Ad5）與英國研制的AZD1222 腺病毒載體疫苗（ChAdOx1）均表現出較高的安全性與較強的免疫反應活性。

2.3 DNA 疫苗

DNA 疫苗的免疫機理是把編碼抗原蛋白的基因插入到含真核表達系統的載體上，再將載有外源基因的載體導入到動物或人體內，來引發機體內的抗腫瘤免疫反應。DNA 疫苗具有許多優點：能夠有效誘導體液和細胞免疫應答、生產相對簡單、生產成本低[17]。利用同一載體即可表達多種抗原。但是，DNA 疫苗存在中樞和外周免疫耐受的問題。

Duperret EK 等[18]報道了一種能夠靶向多種抗原的DNA 疫苗，這種疫苗主要通過電穿孔的方式遞送，可以誘導MHC-Ⅰ類限制性CD8+T 細胞的免疫應答，能產生強大的免疫激活能力，從而使腫瘤特異性T 細胞殺死腫瘤細胞。在一項臨床試驗中，Norell 及其同事使用了DNA 質粒疫苗與低劑量的IL-2（白細胞介素-2）和GM-CSF（粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子）一起給藥，以治療乳腺癌患者，發現疫苗能夠誘導長期的免疫應答反應。Vaccibody 公司研制的DNA 疫苗（VB10.NEO），通過利用患者自身的腫瘤特異性新抗原對患者進行個性化治療，能夠誘導強烈的新抗原特異性免疫應答。

2.4 mRNA 疫苗

mRNA 疫苗主要有兩種類型：常規的mRNA 疫苗和自擴增的mRNA 疫苗。mRNA 疫苗具有許多優勢：安全性高，不存在感染或插入誘變風險；可在體內降解；可通過使用各種修飾途徑和不同的遞送方法來調節其體內半衰期；生產速度快，是最有前途的疫苗平臺[19]。但是，mRNA 疫苗也存在一些缺陷：mRNA 疫苗不穩定，注射之后很容易被代謝清除；mRNA 具有較大的尺寸、較強的親水性、較多的負電荷，造成了其在細胞膜上難以被動擴散，因此需要有效的策略將mRNA 遞送至靶細胞的細胞質內[20]。

Wolff 等，使用mRNA 疫苗平臺，證明小鼠肌肉注射編碼基因的mRNA 疫苗能夠誘導免疫應答；5 年后，Conryet RM等[21]，用編碼癌胚抗原（CEA）的mRNA 注射到小鼠體內，其表現明顯的抗CEA 抗體反應，由此而開發了第一種mRNA癌癥疫苗；德國Loquai C 教授，利用新生抗原制備了RNA疫苗，實驗發現13 名患者均在接種疫苗后有了免疫反應。

2.5 肽疫苗

與其他種類的抗原疫苗相比，肽疫苗具有幾個優勢：穩定性較好、容易合成、成本效率高[22]、副作用較小[23]。最重要的是，肽抗原不易誘發過敏或者自身免疫反應。已有幾例有關肽疫苗的報道：Schumacher T 等合成了含有IDHI（R132H）的新抗原多肽疫苗，與小鼠的神經膠質瘤中的MHC Ⅱ分子結合，發現肽疫苗能夠有效的誘導免疫反應[24]。奧特等合成了多達20 種新抗原的長肽疫苗，在黑色素瘤患者臨床試驗中取得了較好的效果。哈佛大學Catherine J.Wu 教授，合成了新抗原肽疫苗，成功治愈了黑色素瘤。但是，多肽疫苗的發展也面臨著一些挑戰：由于多肽疫苗具有較低的免疫原性且容易通過酶促反應被降解，因此需要正確的遞送方式[25]。

為解決肽疫苗免疫原性低的問題，常需要使用佐劑增強機體對抗原的特異性免疫應答。常用的佐劑有明礬、乳劑（AF03、MF59）、Toll 樣受體激動劑（AS04 中單磷酰酯A、AS01中QS-21）。還可以用肽疫苗與其他免疫療法相結合的方法增強肽疫苗的免疫原性，如肽疫苗與免疫檢查點阻斷劑組合克服了肽疫苗免疫原性低的問題，并誘導更強的抗腫瘤反應[26]。

3 新生抗原的篩選

腫瘤新生抗原的篩選是一個復雜的過程，主要有3 種篩選方法應重點關注（見圖5）。

圖5 新生抗原的篩選方法

方法A：對正常細胞和腫瘤組織的DNA 進行全外顯子組測序，鑒定出腫瘤組織的突變位點[1，12]。然后通過正交驗證或RNA 測序（RNA-seq）評估突變位點等位基因的表達[27]。再通過計算機軟件預測新生抗原與HLA 結合的親和力大小[28]，篩選出來與HLA 親和力較高的新生抗原合成多肽，通過監測IFN-γ、PD-1 等能反映T 細胞活化的共刺激標志物，來鑒定多肽體外的免疫反應活性[29]。有不同的預測算法和軟件用于預測或模擬MHC/新生抗原結合能力：NetMHC、NetChop 和NetCTL，可用于抗原加工和肽轉運過程中抗原表位的預測[30]。HLAMiner、Polysolver 和Optiptype 能夠分別基于NGS 數據和WES 數據確定HLA 分型結果[31]。

方法B：串聯小基因構建體的方法。利用串聯基因技術，可以同時表達多個多肽分子，有效延長肽鏈長度，提高多肽的穩定性。具體的做法是先合成了串聯小基因（TMG）構建體，然后將其作為體外轉錄（IVT）RNA 的模板。再將這些IVT TMG RNA 中的每一個單獨轉染到自體抗原呈遞細胞中，然后與TIL 共培養，以確定TIL 是否識別突變的抗原[32]。串聯小基因可以電穿孔到自體APC 中。無論采用方法A 或者方法B，都不需要建立患者特異性腫瘤細胞系，可以使用不同來源的T 細胞來篩選新生抗原反應性T 細胞[33]。

方法C：基于數據庫或文獻的方式，鑒定出腫瘤細胞的特異性突變位點，然后的步驟可以按照方法A 或者方法B 進行。

4 新生抗原疫苗的遞送方式

4.1 直接注射IVT mRNA

mRNA 疫苗相比其他類型的新生抗原疫苗具有很多優勢：直接以經皮注射的方式把體外轉錄mRNA（IVT mRNA）注入LN（結內注射），能夠增加抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC）對新生抗原的捕獲量，從而可以有效誘導抗腫瘤免疫反應。Sahin 的團隊用編碼多表位的合成mRNA疫苗，治療晚期黑色素瘤患者,發現直接注射IVT mRNA 不僅能提高翻譯效率，而且能增強DC 對MHC Ⅰ類和Ⅱ類分子的抗原呈遞。由于內在的佐劑能力，這些IVT mRNA 還通過Toll 樣受體7（TLR7）信號傳導途徑促進DC 成熟。因此能夠有效激發T 細胞的免疫應答。IVT mRNA 是將遺傳信息傳遞到活細胞中的理想載體，其主要用途之一是將蛋白質遞送到活細胞中。Zhou X 等[34]通過引入IVT mRNA，將重鏈抗體（VHH）或納米體的可變結構域快速遞送到了活細胞，通過在活細胞中表達其IVT mRNA，擴展了納米體/VHH 的應用。

4.2 體外脈沖DC 疫苗

用特定抗原脈沖或者信使mRNA 轉染DC 可以制備新生抗原疫苗[35]。Joshi A 等[36]不僅證明了用趨化因子標記RNA脈沖的DC 能增強抗腫瘤免疫力，也指出了將RNA 轉染到DC 中的方法。但體外脈沖DC 疫苗成本較高，勞動強度大，并且需要高技能的技術人員，這極大地限制了其臨床的應用。

4.3 生物材料輔助新生抗原疫苗的遞送

生物材料可以保護抗原免于降解，并能調節APC 的功能，已被廣泛用于疫苗遞送。Zhu G 等[37]，研發出了自組裝的DNA-RNA 納米膠囊（iDR-NC），該納米材料能將DNACpG 和短發夾RNA（shRNA）以及腫瘤特異性抗原轉移到淋巴的抗原呈遞細胞（APC）中，引發特異性外周CD8+T 細胞的免疫應答并明顯抑制腫瘤的生長。Zhu G 等[38]還將埃文思藍（EB）加入到抗原分子中，設計了新型納米疫苗（被命名為AlbiVax）。EB 能與人的白蛋白結合完成自組裝，有助于增強免疫反應。Luo M 等[39]開發了響應性納米疫苗，這種納米疫苗可根據體內的pH 值變化產生響應信號，能夠實現抗原的交叉呈遞，從而更好地發揮抗腫瘤效果。Démoulins T 等[40]采用了可生物降解的運載工具來保護自擴增復制RNA（RepRNA）、促進DC 輸送。他們將RepRNA 封裝到殼聚糖納米顆粒中，可有效地將RepRNA 遞送至DC 并誘導體內免疫反應。

5 新生抗原疫苗的臨床進展

根據clinical trials.gov 網站的統計，樹突狀（DC）細胞疫苗研究最多，截止到2020 年8 月份，共開展了230 項樹突狀細胞的研究，其中95 項已完成臨床試驗。其次，研究較多的為DNA 疫苗，共進行了206 項研究，已完成臨床試驗的有89 項。部分新生抗原疫苗的臨床開展情況見表1。

表1 部分新生抗原疫苗臨床開展情況

肽疫苗、RNA 個性化癌癥疫苗已經在臨床試驗中取得了成功。德國Ugur Sahin 團隊通過WES 和RNA 測序鑒定，在13 名Ⅲ期和Ⅳ期黑素瘤患者中，表達的非同義突變，基于篩選的新生抗原合成了RNA 疫苗并通過經皮注射的方式給藥[41]。在參與臨床實驗的13 名患者中，8 名在注射新生抗原疫苗后的12 至23 個月內未復發，在接種疫苗前已經出現擴散的5 例患者中，2 例在接種疫苗后腫瘤明顯縮小，1 例在接種PD-1 抑制劑治療后病情完全緩解。美國波士頓Dana-Farber 癌癥中心，為了證明新生抗原的疫苗的可行性、安全性和免疫原性，針對不同的新生抗原，合成了多肽疫苗。在6名接種疫苗的患者中，4 名在接種后25 個月沒有復發，而2名患有復發疾病的患者隨后用PD-1 抑制劑治療后發現腫瘤明顯消退。編碼微衛星（cMS）發生突變可產生免疫原性移碼肽（FSP）新抗原，Kloor M 等[42]為了評估基于FSP 的疫苗的安全性和免疫原性，進行了臨床試驗。證明了FSP 新抗原疫苗安全性高、耐受性好，能持續誘導體液和細胞免疫反應。

6 新生抗原疫苗的局限性

新生抗原疫苗的發展需要克服一些障礙，首先，有些癌癥是“感冒腫瘤”（如胰腺癌和結腸直腸癌），對免疫療法顯示出低反應率。如何使用個性化的癌癥疫苗、提高反應性T 細胞活性，以結合其他的免疫療法對“感冒腫瘤”產生協同的治療效果，需要進一步研究。其次，是腫瘤的免疫逃逸。腫瘤細胞的免疫逃逸主要發生在癌癥早期階段，在復雜的腫瘤微環境中存在很多的免疫抑制機制，來協助腫瘤實現免疫逃逸[43]。一方面，通過MHCI 類分子的下調造成抗原遞呈機制的缺陷是其最主要的機制；另一方面，腫瘤細胞還可以通過阻斷PD-1/PD-L1 通路，抑制T 細胞活化和細胞因子的產生實現逃逸。新生抗原疫苗如何克服腫瘤細胞的免疫逃逸仍是一大難題。

腫瘤的低突變負荷也是新生抗原疫苗研發的一大阻礙。腫瘤具有多變性，能夠產生不同類型的新生抗原。研究的目標就是尋找出新生抗原設計并合成新生抗原疫苗，以此觸發T 細胞的白細胞攻擊癌細胞。腫瘤細胞的突變頻率越高，新生抗原產生的數量越多，具有這種特征的腫瘤免疫治療應答效果越好，這就是腫瘤突變負荷（tumor mutation burden，TMB）。但是有些腫瘤具有較低的突變負荷，不利于免疫藥物起效。具有此類特征的腫瘤患者不適合用癌癥免疫療法。

7 新生抗原疫苗未來發展方向

7.1 新生抗原疫苗的聯合應用

新生抗原疫苗與PD-1/PD-L1 抑制劑的聯合應用具有較好的發展前景。針對腫瘤細胞免疫逃逸問題開發出了PD-1 抑制劑，其能夠激活T 細胞活性、誘導免疫原性因子的分泌。這就解決了新生抗原疫苗難以激活T 細胞的免疫反應的問題。因此，兩者的聯合使用將成為新生抗原疫苗應用的新策略。DC 疫苗與免疫檢查點抑制劑聯合使用，在治療實體瘤和血液瘤方面表現出了明顯的臨床優勢[44]。

7.2 開發多表位疫苗

通過快速丟失表位如MHC Ⅰ類分子下調來抑制抗原的遞呈，是腫瘤細胞免疫逃逸的常見機制，因此需要開發多表位疫苗進行接種。針對多個個性化肽表位，通常含有MHCⅠ限制性肽和MHC Ⅱ類限制性肽，能誘導比現有疫苗更廣泛的免疫應答[45]。

7.3 佐劑和遞送系統

經典佐劑包括TLR 激動劑和將抗原靶向DC 的單克隆抗體。TLR 受體激動劑作為疫苗佐劑被廣泛應用。因為它們不僅能促進DC 成熟為免疫原性狀態，也能誘導細胞因子和趨化因子的釋放，從而引發機體產生持久的免疫應答。針對DC 抗原的單克隆抗體，主要包括抗DEC-205 和CD40 激動劑。DEC-205（CD205）是一種在DCs 上表達的分子，在抗原加工和呈遞中具有廣泛的應用。CD40 是在抗原呈遞細胞（APC）上廣泛表達TNF 受體的超家族成員，它能激活APC并促進抗腫瘤T 細胞應答，進而產生抗癌免疫力。由于腫瘤免疫抑制微環境的存在，新生抗原疫苗難以激活體內的抗腫瘤免疫反應。理想的佐劑和接種途徑應增強免疫反應，打破耐受性并克服免疫抑制性微環境（TME），因此選擇合適的佐劑用于新生抗原疫苗的遞送不失為一種有效的策略。

目前，最理想的疫苗遞送載體是納米顆粒。納米粒子模擬PAMP（病原體相關分子模式），被視為危險信號，并被APC 上的TLR 識別，能夠促進疫苗被APC 識別并攝取。基于納米載體的大小、形狀，表面電荷開發的靶向LN 載體可以增強佐劑的遞送效率。此外，一些納米材料表現出固有的佐劑樣免疫刺激特征，能進一步促進癌癥疫苗的功效。

7.4 與其他常規療法相結合

新生抗原疫苗與其他常規療法如靶向治療、化學療法、放射療法的聯合應用也具有良好的應用前景。從機械學的角度來看，靶向治療與新生抗原疫苗療法具有協同作用。化學療法與免疫療法的聯合應用，其依據在于化療可以通過增加抗原產生，改善抗原呈遞，增強T 細胞反應，從而增強免疫療效。腫瘤細胞在進行放射治療時，由于輻射作用，腫瘤細胞會產生許多新生抗原和促炎細胞因子，從而起到原位疫苗的作用。

8 問題與展望

與其他癌癥免疫療法相比，靶向新生抗原的癌癥疫苗具有許多優勢：安全性高、不存在脫靶毒性、能有效誘導T 細胞免疫反應。此外，新生抗原癌癥疫苗與其他免疫療法相結合的策略，不僅可解決T 細胞免疫反應活性低的問題，還克服了腫瘤免疫抑制微環境，開發新生抗原癌癥疫苗的聯合應用是未來治療癌癥的重要策略。但是，新生抗原疫苗的發展也面臨著一些挑戰：如何解決癌癥對免疫療法固有的低反應率、克服腫瘤細胞的免疫逃逸，針對突變負荷低的腫瘤，如何開展癌癥免疫治療策略，這些是新生抗原癌癥疫苗迫切需要解決的問題。