程世豪，樂建培，黃毅婷，馮嘉辰

1上海市靜安區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200040

2上海市仁濟(jì)醫(yī)院病理科，上海 200127

直腸癌的發(fā)病率普遍較高，約為60%，且發(fā)病人群多為老年人，其作為一種免疫原性相對較強(qiáng)的惡性腫瘤，大多會伴有一定程度的淋巴細(xì)胞浸潤，可能會直接影響患者的預(yù)后。而惡性腫瘤的基本生物學(xué)行為特征為局部組織侵襲或一定方式的轉(zhuǎn)移，最終致死，但機(jī)制尚不明確。高遷移率族蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）是當(dāng)前已經(jīng)證實(shí)的一種與體內(nèi)細(xì)胞增殖、代謝、分化等一系列過程存在明顯關(guān)系的非組蛋白家族成員；其最初處于細(xì)胞核內(nèi)，作為一種內(nèi)源性危險(xiǎn)信號，參與了多種腫瘤的生理活動。當(dāng)其釋放到細(xì)胞外，會引發(fā)機(jī)體的相關(guān)免疫反應(yīng)，并且在腫瘤細(xì)胞的生長過程中，最終促進(jìn)組織局部血管生成，有利于腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，故其在直腸癌患者預(yù)后方面的作用值得研究。當(dāng)前研究很少將焦點(diǎn)集中于HMGB1 在腫瘤組織內(nèi)的表達(dá)情況、表達(dá)位置，以及對直腸癌的潛在意義。故本次研究對HMGB1 在直腸癌患者中的表達(dá)情況進(jìn)行探索，同時(shí)明確其在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)位置，并且通過生存分析明確其對患者預(yù)后的影響，一方面，為臨床此類疾病的診斷、治療提供一定的理論依據(jù)，另一方面進(jìn)一步探討其在直腸癌中的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016 年1 月至2017 年10 月上海市靜安區(qū)中心醫(yī)院收治的直腸癌患者的病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合直腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；均行直腸癌根治術(shù)；未合并嚴(yán)重的臟器損傷；意識清晰，能夠完成正常交流。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并精神疾病；治療期間不配合或者拒絕治療；術(shù)后隨訪期間依從性差。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入78 例直腸癌患者，其中男50例，女28 例；病程2～5 年，平均（3.2±0.7）年。收集78 例患者的腫瘤組織及癌旁組織。

1.2 檢測方法

1.2.1 免疫組化法檢測HMGB1 蛋白的表達(dá)情況將獲得的臨床病理組織脫蠟，以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）充分清洗3 次，每次5 min；完成后切片并放于室溫環(huán)境下30 min，再以PBS 充分清洗3 次，每次5 min。室溫環(huán)境下，牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）處理10 min，4 ℃條件下加入HMGB1 TREM-1 一抗。PBS 清洗3 次，每次5 min，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素液，進(jìn)行室溫下孵育，10 min 后PBS 清洗3 次，每次5 min，羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗在同樣環(huán)境下20 min，PBS 清洗3 次，每次5 min，再次采用Alexa-Fouor 488 羊 抗 兔IgG 二 抗，20 min 后PBS 清 洗3次，每次5 min，最后對獲得的最終樣本采用環(huán)辛二烯進(jìn)行顯色，蘇木精復(fù)染，分化，脫水，膠封。由2名以上醫(yī)師將最終的免疫組化樣本于光鏡下檢測HMGB1蛋白表達(dá)情況，鏡下可見直腸癌組織細(xì)胞呈棕色則為HMGB1陽性表達(dá)，其他則為陰性表達(dá)。

1.2.2 組織內(nèi)免疫淋巴細(xì)胞浸潤情況檢測 組織樣本剪碎，37 ℃RPMI 1640 和HEPES 混合并充分?jǐn)嚢杈鶆? h，有效分離獲得樣本上清，HBSS 清洗3 次，離心后收集淋巴細(xì)胞，以單細(xì)胞懸液的形式將樣本與鼠抗人CD3-APC、CD45ROPE 熒光抗體混合均勻，并4 ℃孵育30 min，再以流式細(xì)胞儀檢測組織內(nèi)免疫淋巴細(xì)胞CD3、CD45RO的表達(dá)情況。400 倍顯微鏡視野下觀察到CD45RO細(xì)胞個(gè)數(shù)24 個(gè)及以上為高密度，24 個(gè)以下為低密度；CD3細(xì)胞個(gè)數(shù)16 個(gè)及以上為高密度，小于16 個(gè)為低密度。

1.3 觀察指標(biāo)

①腫瘤組織中HMGB1 與免疫淋巴細(xì)胞浸潤情況的關(guān)系；②HMGB1 與直腸癌患者臨床特征的關(guān)系；③對患者術(shù)后隨訪40 個(gè)月，了解患者從術(shù)后到死亡/復(fù)發(fā)的生存時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用

χ

檢驗(yàn)；等級資料的比較采用秩和檢驗(yàn)；多因素分析采用Cox 風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析；采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，生存情況的比較采用Log-rank 檢驗(yàn)；以

P

﹤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HMGB1 表達(dá)情況的比較

直腸癌組織中HMGB1 表達(dá)情況高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

Z

=3.152，

P

﹤0.05），其中，直腸癌組織中HMGB1 高表達(dá)最為突出。（表1）

表1 直腸癌組織及癌旁組織中HMGB1 蛋白表達(dá)情況

2.2 不同臨床特征直腸癌患者直腸癌組織中HMGB1 蛋白表達(dá)情況的比較

不同病理分期、腫瘤結(jié)節(jié)情況、CD3浸潤情況、CD45RO浸潤情況、脈管癌栓或神經(jīng)侵犯情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況的直腸癌患者的直腸癌組織中HMGB1 蛋白表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹤0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征的直腸癌患者直腸癌組織中HMGB1蛋白表達(dá)情況的比較

2.3 HMGB1表達(dá)部位與淋巴細(xì)胞浸潤情況的關(guān)系

對70 例存在HMGB1 表達(dá)的組織進(jìn)一步檢測，其中核表達(dá)55 例，核質(zhì)共表達(dá)15 例；HMGB1 核表達(dá)的直腸癌組織中淋巴細(xì)胞CD3、CD45RO高密度浸潤比例較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=12.035、9.573，

P

﹤0.05）。（表3）

表3 HMGB1不同表達(dá)部位的直腸癌組織中淋巴細(xì)胞浸潤情況

2.4 生存情況

隨訪40 個(gè)月，78 例患者中死亡59 例，生存19例，平均生存時(shí)間為（19.89±1.29）個(gè)月。比較不同HMGB1表達(dá)部位、表達(dá)情況、免疫淋巴細(xì)胞浸潤情況的直腸癌患者的生存時(shí)間發(fā)現(xiàn)，HMGB1核表達(dá)、HMGB1高表達(dá)、CD3低密度浸潤、CD45RO低密度浸潤患者的生存時(shí)間分別短于HMGB1 核質(zhì)共表達(dá)、HMGB1 低/無表達(dá)、CD3高密度浸潤、CD45RO高密度浸潤患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=12.235、14.560、4.192、5.753，

P

﹤0.05）。（圖1～圖4）

圖1 HMGB1核表達(dá)（n=55）與核質(zhì)共表達(dá)（n=15）直腸癌患者的生存曲線

圖2 HMGB1高表達(dá)（n=53）與低/無表達(dá)（n=25）直腸癌患者的生存曲線

圖3 CD3+高密度浸潤（n=57）與CD3+低密度浸潤（n=13）直腸癌患者的生存曲線

圖4 CD45RO+高密度浸潤（n=55）與CD45RO+低密度浸潤（n=15）直腸癌患者的生存曲線

2.5 直腸癌患者生存時(shí)間的影響因素分析

多因素分析發(fā)現(xiàn)，HMGB1 表達(dá)部位、病理分期、CD3浸潤情況、CD45RO浸潤情況均為直腸癌患者生存時(shí)間的影響因素（

P

﹤0.05）。（表4）

表4 直腸癌患者生存時(shí)間的影響因素分析

3 討論

HMGB1 在細(xì)胞代謝過程方面，是一種能夠與DNA 有效結(jié)合的蛋白，可廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)，并且能夠有效參與細(xì)胞的增殖、生長、運(yùn)動等一系列過程，對該指標(biāo)進(jìn)行早期檢測，有利于直腸癌的盡早發(fā)現(xiàn)，為臨床的診療提供重要價(jià)值。此外，該指標(biāo)作為當(dāng)前臨床腫瘤患者的診斷腫瘤標(biāo)志物之一，也是臨床靶向治療的靶點(diǎn)之一。有研究顯示，其能夠一定程度有效激活p38、促分裂原活化的 蛋 白 激 酶（mitogen- activated protein kinase，MAPK）等一系列通路，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的持續(xù)活化，激發(fā)其生長信號。本研究結(jié)果顯示，直腸癌組織中HMGB1 表達(dá)情況高于癌旁組織，尤其以高表達(dá)為主要表現(xiàn)，且經(jīng)顯微鏡下可見不同程度的染色，充分說明了這一事實(shí)。

此外，通過進(jìn)一步對HMGB1 與患者臨床特征的關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，不同病理分期、腫瘤結(jié)節(jié)、CD3浸潤情況、CD45RO浸潤情況、脈管癌栓或神經(jīng)侵犯情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況的直腸癌患者的直腸癌組織中HMGB1 蛋白表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹤0.05）。直腸癌人群中HMGB1 的表達(dá)能夠提示患者局部可能存在較為明顯的淋巴細(xì)胞浸潤或轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等風(fēng)險(xiǎn)，也提示在已經(jīng)確診為直腸癌的患者中，HMGB1 高表達(dá)也與局部腫瘤組織的無限增殖或一定程度的血管生成有關(guān)。而有研究發(fā)現(xiàn)，對于接受放療之后壞死的直腸癌細(xì)胞依舊能夠激活腫瘤細(xì)胞的增殖，并且HMGB1 表達(dá)水平也會出現(xiàn)一定增高，這也充分說明了該指標(biāo)是作為患者預(yù)后不良的一個(gè)新的標(biāo)志物。另有研究針對轉(zhuǎn)化控制腫瘤蛋白對機(jī)體內(nèi)的HMGB1 相關(guān)行為進(jìn)行一定的調(diào)控，進(jìn)而促進(jìn)直腸癌轉(zhuǎn)移，這充分說明了HMGB1 高表達(dá)與直腸癌的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系緊密，也證實(shí)了本研究中提示的HMGB1 與轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

此外，進(jìn)一步對HMGB1 高表達(dá)情況與免疫淋巴細(xì)胞浸潤的關(guān)系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)HMGB1 高表達(dá)患者直腸癌組織中CD3、CD45RO的浸潤情況較為顯著；對存在HMGB1 表達(dá)的組織進(jìn)一步檢測，發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞核表達(dá)與核質(zhì)共表達(dá)共同存在，尤其以核表達(dá)情況下的免疫淋巴細(xì)胞浸潤情況最為突出。這都提示，直腸癌患者體內(nèi)HMGB1 表達(dá)以核表達(dá)為主，并且會伴隨著典型的免疫淋巴細(xì)胞浸潤。分析認(rèn)為，這可能是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞內(nèi)HMGB1釋放至細(xì)胞外，可引發(fā)機(jī)體以CD3、CD45RO為典型代表的記憶性T 淋巴細(xì)胞（是腫瘤免疫反應(yīng)的重要細(xì)胞之一）腫瘤相關(guān)免疫反應(yīng)，在腫瘤的病灶組織內(nèi)其密度相對較高。尤其在HMGB1 高表達(dá)情況下，患者可能存在一定程度的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，局部組織內(nèi)的免疫淋巴細(xì)胞也會相對呈現(xiàn)聚集，密度較大，以最大程度抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和擴(kuò)散，這也可能影響患者的生存時(shí)間，因此對于直腸癌患者，CD45RO較高急需及時(shí)進(jìn)行臨床干預(yù)，以改善患者預(yù)后，降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。而HMGB1一旦釋放至細(xì)胞外環(huán)境，即可引起相應(yīng)的樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞有效活化，進(jìn)而一定程度上誘導(dǎo)免疫耐受。但是其具體引起免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制值得研究。此外，這也說明了HMGB1 在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)較高的情況下，免疫淋巴細(xì)胞浸潤情況也較為明顯，一定程度上反映了HMGB1 可能通過機(jī)體內(nèi)的免疫機(jī)制影響腫瘤進(jìn)展。

隨訪40 個(gè)月，78 例患者中死亡59 例，生存19例，生存時(shí)間為（19.89±1.29）個(gè)月。比較不同HMGB1 表達(dá)部位、表達(dá)情況、免疫淋巴細(xì)胞浸潤情況的直腸癌患者的生存時(shí)間發(fā)現(xiàn)，HMGB1 核表達(dá)、HMGB1 高表達(dá)、CD3低密度浸潤、CD45RO低密度浸潤患者的生存時(shí)間分別短于HMGB1 核質(zhì)共表達(dá)、HMGB1 低/無表達(dá)、CD3高密度浸潤、CD45RO高密度浸潤患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹤0.05）。通過對生存時(shí)間的影響因素進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，HMGB1 表達(dá)部位、病理分期、CD3浸潤情況、CD45RO浸潤情況均為直腸癌患者生存時(shí)間的影響因素（

P

﹤0.05）。也提示HMGB1 表達(dá)情況與患者的預(yù)后可能存在一定的關(guān)系，也提示臨床對于結(jié)腸癌的治療需要嚴(yán)密監(jiān)測患者術(shù)后或化療后的指標(biāo)，為及時(shí)診斷患者是否存在復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等情況，提供一定的幫助。

綜上所述，HMGB1 在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，且多存在于細(xì)胞核內(nèi)，HMGB1 高表達(dá)的直腸癌患者的病灶內(nèi)有較為明顯的免疫淋巴細(xì)胞浸潤，此類患者生存時(shí)間相對較短，這提示可通過機(jī)體內(nèi)的免疫機(jī)制而影響腫瘤進(jìn)展。且經(jīng)多因素分析發(fā)現(xiàn)，HMGB1 表達(dá)部位、病理分期、淋巴細(xì)胞浸潤均為患者預(yù)后的影響因素，而HMGB1 表達(dá)不能作為患者預(yù)后的影響因素。因此臨床對于結(jié)腸癌HMGB1 表達(dá)及免疫淋巴細(xì)胞動態(tài)監(jiān)測，能夠幫助了解患者的預(yù)后情況，為調(diào)整治療方案提供一定的幫助。