超高效液相-串聯質譜法測定糕點中的三氯蔗糖

梁婷婷 曾云想

摘要： 建立了檢測糕點中三氯蔗糖的超高效液相-串聯質譜（UPLC-MS/MS）測方法。樣品經亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液去除糕點中蛋白、油脂等雜質后， 用甲醇和0.1%甲酸水溶液為流動相進行梯度洗脫， 采用Aglient Eclipse Plus C18 （3.0×100mm）分離后，用電噴霧負離子（ESI-）模式離子化，選擇多反應檢測（MRM）方式監測，串聯質譜測定，外標法定量。實驗結果表明：三氯蔗糖在0.1-3.0ng/mL范圍內呈良好的線性關系， 相關系數為r=0.998， 三氯蔗糖的方法檢出限為 0.1μg/kg，回收率為93.8%-97.6%， 相對標準偏差（ RSD） 為1.38%。 本方法快速簡便， 操作穩定， 可適用于糕點三氯蔗糖的質量控制檢測。

關鍵詞： 三氯蔗糖;超高效液相-串聯質譜;干擾少

傳統食品工業長期以來主要以糖類作甜味劑，傳統糕點中常用的糖類物質如蔗糖、葡萄糖、果糖等。這些糖類甜味物質多呈現高營養性、高安全性、高發熱值及低甜度、大添加量的特點，長期大量食用，易引起心血管疾病、肥胖癥、糖尿病及齲齒等，嚴重威脅人體健康。由于我國老齡化程度不斷增加，忌糖隊伍越來越大，食品將進一步趨于低熱量、低糖。因此，開發應用安全健康的低熱量、高甜度及具有功能性的非營養性甜味劑，以滿足健康、科學飲食需求顯得尤為迫切。三氯蔗糖是以蔗糖為原料的功能性的甜味劑，1976年由英國泰萊公司與倫敦大學共同研制并申請專利，具有無能量、高甜度、純正甜味、安全度高等特點，其甜度可達蔗糖甜度約600倍。美國食品藥品監督管理局（FDA）早在1998年批準三氯蔗糖上市之前，參照了100多項實驗數據，未發現其在生殖系統，神經系統方面毒性以及未發現誘發癌癥的反應。我國1997年正式批準使用三氯蔗糖之前同樣經過了一系列的實驗證實了其安全性。

三氯蔗糖在我國使用廣泛，目前對于三氯蔗糖分析方法主要有高效液相色譜法、離子色譜法和氣相色譜-串聯質譜法等，現行的國家標準GB 22255-2014《食品安全國家標準食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的測定》中使用的是高效液相色譜法。由于糕點中成分復雜，氣相色譜串聯質譜法中前處理需進行衍生化過程繁瑣，并且三氯蔗糖的性質較黏，氣相色譜儀進樣量小容易引起誤差導致實驗重現性不好;高效液相色譜法測定三氯蔗糖方法檢測器穩定時間長，過程復雜。因而應用此方法實驗周期長。本文研究縮短提取時間，簡化處理過程，檢出限低、干擾少適用于糕點中三氯蔗糖檢測的需要。

1. 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent1290-6460型超高效液相-串聯質譜儀;KH3200B型臺式超聲波清洗器;Direct-Pure UP型純水機;梅特勒LE204E/02型分析天平;固相萃取柱。

三氯蔗糖標準溶液20mg/mL;甲醇、甲酸、正己烷為HPLC級。

乙酸鋅、亞鐵氰化鉀分析純。

1.2 儀器工作條件

1.2.1色譜條件

Aglient ZDRBAX RRHD Eclipse Plus C18色譜柱（3.0mm×100mm），流動相：A為0.1%（體積分數，下同）甲酸水溶液，B為甲醇;柱溫35℃，進樣量10?L。流動相梯度洗脫程序：0min，A為95%;0-2min，A由95%降至30%;2-3min，A由30%升至50%;3-3.2min，A由50%降至10%;3.2-4.1min，A由10%升至95%;4.1-7.0min，A為95%。流量0.3mL/min。

1.2.2質譜條件

電噴霧電離負離子模式（ESI-）;質譜掃描方式：多反應離子監測（MRM）;脫溶劑氣：氮氣;碰撞氣：氬氣;干燥氣流量：10L/min;干燥氣溫度：350℃;毛細管電壓：3.0kV;噴霧壓力：207KPa。其他質譜參數見表1。其中*為定量離子。

1.3 實驗方法

稱取粉碎均勻后的固體試樣2g精確到0.001g置于50mL離心管中，加入5mL水，旋渦振蕩器振蕩2min后加入15mL甲醇，繼續振蕩30s，超聲提取20min，然后以8000r/min冷凍離心3min，移取上清液，殘渣用75%甲醇再次提取，合并2次提取液，將提取液用30mL正己烷凈化后移取下層溶液，將提取液通過依次用5mL甲醇和5mL水活化的固相萃取小柱，再加入1mL水淋洗，待柱中液體完全流出后，用3mL甲醇洗脫，收集洗脫液。洗脫液于75℃水浴氮吹近干，甲醇定容至1mL，過0.45μm微孔濾膜供液質分析。

2. 結果與分析

2.1 前處理條件的優化

現行GB 22255-2014在樣品制備過程中，其轉速為3000r/min時間10min。優化條件將轉速增為8000r/min冷凍離心3min，樣品在低溫條件下分層效果更好，不易堵塞凈化柱，且能縮短前處理時間。

2.2 質譜條件的優化

實驗考察三氯蔗糖正離子模式下，無法產生相應的[M+H]+準分子離子峰，而在ESI負離子模式下有良好的信號，因此選擇ESI負離子模式下進行三氯蔗糖的測定。將1ng/mL的標準溶液在負離子模式下進行全掃描，再通過MRN，優化質譜條件，選擇最佳子離子，同時優化碰撞能量。最后確定 m/z395.1>358.9作為定性離子對，m/z395.1>35.1作為定量離子對（見表1）。

2.3 校準曲線的繪制

對質量濃度為0.1-3.0ng/mL的標準工作液進行測定，配制質量濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.0、3.0ng/mL，繪制線性曲線。得到線性回歸方程y=458.16x+16.82，相關系數R2=0.998，線性范圍0.1-3.0ng/mL。以S/N=3計，三氯蔗糖的最小檢出限為0.1μg/kg，以S/N=10計，該方法的定量檢測限為 0.5μg/kg。

2.4 精密度的測定

取1.00ng/mL的標準溶液，按選定的實驗條件連續測試6次，相對標準偏差（RSD）%為1.38%。

2.5 加標回收率的測定

稱取適量樣品，按線性范圍分別加入三個濃度的三氯蔗糖標準物質，進行加標回收實驗。平均加標回收率為95.3%，測定結果準確可靠，滿足日常檢測要求。

3. 結果與討論

本工作建立了測定糕點中三氯蔗糖的超高效液相-串聯質譜法，實驗結果表明：三氯蔗糖在0.1-3.0ng/mL范圍內呈良好的線性關系， 相關系數為r=0.998，三氯蔗糖的方法檢出限為 0.1μg/kg，回收率為93.8%-97.6%，相對標準偏差（RSD）為1.38%。本方法檢出限低，回收率、重復性等結果均優于同等條件的氣相色譜-質譜聯用法和液相色譜法，可滿足糕點中三氯蔗糖的檢測要求。