重組豬抗菌肽乳酸菌的構建及其應用效果

劉東旭 ， 沙萬里 , 尹柏雙 , 李國江

(1. 吉林農業科技學院動物科技學院 ， 吉林 吉林 132101；2. 預防獸醫學吉林省重點實驗室 ， 吉林 吉林 132101)

養豬業是我國畜牧業重要的支柱之一，為提高生產效率，在現代養豬生產中，普遍采用早期斷奶技術，然而由于免疫發育不全以及斷奶造成的各種應激，導致仔豬腹瀉成為現代養豬業亟待解決的重要問題之一[1]。

抗菌肽是由12～100個氨基酸殘基組成的一類蛋白質或多肽，通過與細菌細胞膜或其他靶點作用殺滅細菌[2]。本試驗以乳酸菌作為表達載體，重組豬β-防御素及PR-39抗菌肽(Proline-arginine rich 39-amino acid peptide，PR-39)，觀察其對斷奶仔豬生長性能和微生態體系的影響，從而為研制防治仔豬腹瀉的綠色無抗飼料添加劑提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 細菌選擇培養基、生化鑒定瓶，均購自廣東環凱微生物科技有限公司；質粒DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒，均購自愛思進生物技術(杭州)有限公司；PCR酶、TaqMan酶、DNA marker、pGEM-T SimpleVector，均購自寶日醫生物技術(北京)有限公司。

1.2 重組乳酸菌表達質粒的構建 根據GenBank上公布的β-防御素及PR-39抗菌肽序列設計特異性引物，由長春庫美生物公司合成USP45信號肽序列。通過重疊延伸PCR法將β-防御素、PR-39抗菌肽及其融合產物與USP45信號肽進行連接。采用NcoⅠ+XbaⅠ雙酶切乳酸菌表達質粒pNZ8148，根據同源臂重組技術分別將β-USP45、PR-39-USP45及融合基因β-PR-39-USP45與線性化的pNZ8148載體連接，電轉入乳酸菌宿主NZ9000中并進行鑒定。

1.3 重組乳酸菌的表達及鑒定 將重組乳酸菌置于含有氯霉素及乳酸鏈球菌素(Nisin)的MRS培養基培養24 h，分別收集培養液和菌體進行濃縮，應用SDS-PAGE檢測重組蛋白。

1.4 重組乳酸菌的體外抑菌試驗 將100 mL重組乳酸菌誘導表達24 h后，破碎菌體并進行100倍濃縮。在1 mL三種重組乳酸菌和空載體濃縮液中，加入9 mL液體LB培養基，并分別加入10 μL大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌(OD600=0.1)，37 ℃培養并繪制細菌生長曲線。

1.5 三種重組乳酸菌對斷奶仔豬腹瀉的影響

1.5.1 試驗動物分組 將健康的21日齡三元雜交斷奶仔豬隨機分為5組，每組3個重復，每個重復3頭仔豬。空白對照組為MRS培養基組(A)，空載體pNZ8148組(B)，重組乳酸菌pNZ8148-β組(C)，重組乳酸菌pNZ8148-PR-39組(D)， 重組乳酸菌pNZ8148-β-PR-39組(E)。每組在每天的8時和16時 給料前胃內灌注50 mL，試驗期為28 d。

1.5.2 生長指標及腹瀉率的測定 每日8時稱量空腹仔豬重，計算平均日增重。觀察仔豬糞便形態、顏色及腹瀉情況,計算腹瀉率及腹瀉指數[3]。

1.5.3 細菌分離鑒定 試驗第28天無菌手術收集各組仔豬腸道內容物1 g，并溶于1 mL PBS中，進行10倍倍比稀釋，進行細菌計數及鑒定。

1.5.4 統計學分析 試驗結果以平均值±標準差方式表示。采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析，使用t檢驗法進行差異顯著性檢驗。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 重組乳酸菌的構建及鑒定 通過PCR擴增，分別得到273、399 bp和260 bp的特異性條帶(圖1)，與預期片段大小相符，成功構建重組乳酸菌，分別命名為pNZ8148-β、pNZ8148-PR-39和pNZ8148-β-PR-39。

圖1 重組乳酸菌PCR鑒定結果Fig.1 The PCR results of recombinant lactic acid bacteriaM： 50 bp ladder相對分子質量標準； 1： pNZ8148-PR-39 PCR鑒定結果； 2： pNZ8148-β-PR-39 PCR鑒定結果； 3： pNZ8148-β PCR鑒定結果M: 50 bp ladder DNA marker; 1: PCR result of pNZ8148-PR-39; 2: PCR result of pNZ8148-β-PR-39; 3: PCR result of pNZ8148-β

2.2 重組乳酸菌的誘導表達及鑒定 重組乳酸菌上清液和菌體中，外源基因表達蛋白的SDS-PAGE電泳檢測結果如圖2所示，與空載體pNZ8148相比，pNZ8148-β在10.0 kDa處、pNZ8148-PR-39在9.5 kDa處、pNZ8148-β-PR-39在14.5 kDa處，誘導的上清液和菌體中均有外源蛋白的表達。

圖2 重組乳酸菌SDS-PAGE結果Fig.2 The SDS-PAGE results of recombinant lactic acid bacteriaM： 14.3～97.2 kDa蛋白 marker； 1： pNZ8148-β上清液SDS-PAGE電泳結果； 2： pNZ8148-β菌體SDS-PAGE電泳結果； 3： pNZ8148-PR-39上清液SDS-PAGE電泳結果； 4： pNZ8148-PR-39菌體SDS-PAGE電泳結果； 5： pNZ8148-β-PR-39上清液SDS-PAGE電泳結果； 6： pNZ8148-β-PR-39菌體SDS-PAGE電泳結果； 7、8、9： pNZ8148空載體SDS-PAGE電泳結果M: Protein marker(14.3- 97.2 kDa); 1: SDS-PAGE results ofpNZ8148-β supernatant; 2: SDS-PAGE results of pNZ8148-βthallus; 3: SDS-PAGE results of pNZ8148-PR-39 supernatant; 4: SDS-PAGE results of pNZ8148-PR-39 thallus; 5: SDS-PAGE results of pNZ8148-β-PR-39 supernatant； 6： SDS-PAGEresults of pNZ8148-β-PR-39 thallus; 7,8,9: SDS-PAGE results of pNZ8148 blank vector

2.3 重組乳酸菌的體外抑菌試驗結果 動態生長曲線測定重組乳酸菌抑菌活性結果如中插彩版圖3所示，3種重組乳酸菌對大腸桿菌、沙門菌的生長均有一定的抑制作用，pNZ8148-β和pNZ8148-β-PR-39對金黃色葡萄球菌的抑制作用稍弱，而重組乳酸菌pNZ8148-PR-39對金黃色葡萄球菌無明顯抑制作用。

圖3 重組乳酸菌的體外抑菌試驗Fig.3 In vitro antibacterial test of recombinant lactic acid bacteriaA: 大腸桿菌； B: 沙門菌； C: 金黃色葡萄球菌A: Escherichia coli； B: Salmonella； C: Staphylococcus aureus

2.4 重組乳酸菌對仔豬腸道菌群的影響 各組腸道內容物細菌計數結果如圖4所示，仔豬基礎日糧中添加重組乳酸菌可降低腸道中大腸桿菌數量(P<0.05)。pNZ8148-β和pNZ8148-β-PR-39重組乳酸菌組對金黃色葡萄球菌及腸球菌抑制作用明顯(P<0.05)。

圖4 重組乳酸菌對仔豬腸道主要菌群的影響Fig.4 The effect of recombinant lactic acid bacteria on the main intestinal flora of piglets注：不同小寫字母表示組間差異顯著，P<0.05Note: Different lowercase letters mean significant difference among groups,P<0.05

2.5 重組乳酸菌對仔豬生產性能的影響 斷奶仔豬的生產性能指標監測結果如表1所示，仔豬的初始體重沒有顯著差異(P>0.05)，試驗結束后，重組乳酸菌組的平均日增重顯著高于對照組(P<0.05)，且呈現pNZ8148-β-PR-39>pNZ8148-β> pNZ8148-PR-39趨勢。對照組、pNZ8148-β、pNZ8148-PR-39、pNZ8148-β-PR-39的料肉比分別為1.47、1.39、1.41和1.37。對比對照組，其料肉比分別降低了5.44%、4.08%和6.80%，差異顯著(P<0.05)。

表1 重組乳酸菌對仔豬生產性能的影響Table 1 Effect of recombinant lactic acid bacteria on growth performance of piglets

2.6 重組乳酸菌對仔豬腹瀉率及腹瀉指數的影響 各組斷奶仔豬腹瀉率與腹瀉指數所得結果如表2所示，仔豬基礎日糧中添加重組乳酸菌后，腹瀉率與對照組相比明顯降低(P<0.05)。對比各組腹瀉指數及腹瀉率，pNZ8148-β-PR-39組對比對照組差異極顯著(P<0.01)，腹瀉率降低39.62%，腹瀉指數降低33.07%。

表2 重組乳酸菌對斷奶仔豬腹瀉率及腹瀉指數的影響Table 2 Effect of recombinant lactic acid bacteria on diarrhea rate and diarrhea index of weaned piglets

3 討論

內源抗菌肽作為飼料添加劑，在維持腸道菌群平衡和抵御外源病原菌侵害方面比外源抗菌肽更具優勢[4]。因為腸道菌群平衡主要依靠內源益生菌和抗菌肽的調節作用。在動物進化的漫長進程中，動物腸道中內源的益生菌和抗菌肽建立了相互適應機制，腸道益生菌可以和抗菌肽共存[5]。本試驗結果表明，3種重組蛋白的濃縮液對大腸桿菌、沙門菌均有一定的抑制效果，但PR-39抗菌肽對金黃色葡萄球菌沒有檢測到顯著的抗菌活性，而β-防御素則對大腸桿菌、沙門菌及金黃色葡萄球菌均有很好的抑制效果。PR-39含有豐富的脯氨酸，能抗多種革蘭陰性菌，如大腸桿菌、鼠傷寒沙門菌、肺炎克雷伯桿菌等[[6]。Agerberth等對PR-39的抑菌分析研究結果顯示，其能夠抑制大腸桿菌、醋酸鈣不動菌和鼠傷寒沙門菌[7]。β-防御素富含半胱氨酸和精氨酸，它是動物黏膜組織，特別是胃腸道和呼吸道等抵御病原微生物的一道天然屏障[8]。β-防御素對革蘭陰性菌和革蘭陽性菌都具有殺傷作用。綜合以上研究成果可以看出，本試驗結果與其他學者研究一致。

本試驗以表達豬β-防御素和PR-39抗菌肽的乳酸菌飼喂仔豬，簡化傳統的基因工程表達產物純化操作，發揮了乳酸桿菌和抗菌肽的益生功效，明顯改善了仔豬生長性能，為新型綠色飼料添加劑的研制和應用提供了依據。