骨髓間充質干細胞聯合柴胡疏肝丸對大鼠急性肝損傷的作用研究

鄭佳琳，饒子亮，黃小紅，武 昕，黃小瓊，許惠英，鄺少松

（廣東省醫學實驗動物中心，廣東佛山 528248）

目前，急性肝損傷在諸多急性臨床病例中屢見不鮮，且呈現出逐年上升的趨勢，嚴重威脅著人類的健康。柴胡疏肝丸主要用于治療肝氣郁滯證，而骨髓間充質干細胞療法在肝臟疾病治療領域中占據了非常重要的位置。因此，本課題研究急性肝損傷藥物四氯化碳（CCl4）誘導大鼠急性肝損傷模型，以MSCs 聯合柴胡疏肝丸對急性肝損傷進行治療，觀察是否具有改善大鼠肝功能的作用，初步探討其作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及實驗環境

SPF級SD大鼠，雄性，100只，體重200～250 g，購于廣東省醫學實驗動物中心[SCXK（粵）2018-0002]。動物飼養在廣東省醫學實驗動物中心SPF級動物房[SYXK（粵）2018-0002]。動物飼養條件：5 只/箱，群養，飼養溫度與濕度：20℃～26℃，40%～70%，采用10 h:14 h 晝夜間斷照明；飼養室條件始終保持穩定，以保證試驗結果的可靠性。自由進食飲水，飼料和飲用水均由廣東省醫學實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑與儀器

柴胡舒肝丸、四氯化碳（CCl4）、EA3001 系列電子天平、7020 型全自動生化分析儀。

1.3 細胞培養

體外大量培養大鼠骨髓間充質干細胞，選擇處于對數生長期及狀態良好的細胞進行給藥治療。

1.4 動物造模

將檢疫合格的100 只SPF 級雄性SD 大鼠按照體重隨機分為空白對照組、模型對照組、柴胡疏肝丸組、MSCs 組、聯合用藥組，每組20 只。除空白對照組外，其余大鼠以 2 mL/kg 劑量腹腔注射CCl4溶液（CCl4按1:1 比例與橄欖油混合配制成CCl4溶液）1 次，誘導大鼠產生急性肝損傷。

1.5 動物給藥

造模后次日，MSCs 和聯合用藥組大鼠一次性尾靜脈注射1.0×107個/ml 的MSCs；柴胡疏肝丸組和聯合用藥組大鼠灌胃給予70 g/kg 柴胡疏肝丸，空白對照組和模型對照組灌胃給予等量純凈水，每天1 次，連續給藥7 d。

1.6 肝功能檢測

開始治療后的第1 天、第2 天、第3 天和第7 天，各組隨機選取5 只大鼠，稱重，CO2處死，采血分離血清，全自動生化分析儀測定肝功能指標，即谷草轉氨酶（AST）和谷丙轉氨酶（ALT）；收集肝臟組織并稱重，計算肝指數。肝指數=肝濕重/體重×100%。

1.7 統計方法

實驗所得數據用SPSS 21.0 軟件進行統計，結果用（±s）表示，各組數據進行方差齊性檢驗，同時進行單因素方差分析，P ＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 治療后大鼠肝指數變化

結果顯示，對模型對照組大鼠注射CCl4后，模型對照組大鼠肝指數顯著高于空白對照組（P＜0.05），說明造模成功。柴胡疏肝丸組、MSCs組和聯合用藥組大鼠肝指數在4 個時間點上均低于模型對照組。聯合用藥組大鼠肝指數顯著低于模型對照組（P ＜0.05）。聯合用藥組肝指數與柴胡疏肝丸組、MSCs 組比較均有所降低，說明MSCs、柴胡疏肝丸對肝臟重量指數均起到緩解作用；聯合治療效果優于MSCs 和柴胡疏肝丸單獨治療的效果。隨著時間的延長，各組肝指數都有所回落（表1）。

表1 治療后的大鼠肝指數結果（±s，%，n=5，♂）

表1 治療后的大鼠肝指數結果（±s，%，n=5，♂）

注：與空白對照組比較，*P ＜0.05；與模型對照組比較，△P ＜0.05。

組別d1d2d3d7空白對照組3.87±0.233.94±0.16 3.87±0.213.88±0.12模型對照組5.53±0.26*5.41±0.14*5.34±0.21*4.47±0.25*柴胡疏肝丸組5.49±0.28* 5.18±0.26*5.01±0.31* 4.04±0.25△MSCs組5.38±0.21*5.10±0.23*△ 5.07±0.24*3.97±0.22△聯合用藥組5.21±0.13*△4.74±0.17*△4.52±0.27*△3.92±0.12△

2.2 治療后大鼠血清中谷丙轉氨酶（ALT）濃度變化

結果顯示，在4 個時間點，模型對照組 ALT濃度明顯高于空白對照組（P ＜0.05），柴胡疏肝丸組、MSCs 組和聯合用藥組 ALT 濃度明顯低于模型對照組（P ＜0.05）。在 d7 時，聯合用藥組ALT 濃度與空白對照組基本持平，差異不顯著（P＞0.05），肝功能恢復較好（表2）。

表2 治療后的大鼠肝ALT 結果（±s，U/L，n=5，♂）

表2 治療后的大鼠肝ALT 結果（±s，U/L，n=5，♂）

注：與空白對照組比較，*P ＜0.05；與模型對照組比較，△P ＜0.05。

組別d1d2d3d7空白對照組27±529±2 28±528±5模型對照組377±16*253±13*68±7*57±6*柴胡疏肝丸組352±10*△216±9*△46±6*△39±4*△MSCs組333±15*△195±14*△ 50±9*△38±7*△聯合用藥組252±16*△161±11*△45±8*△32±5△

2.3 治療后大鼠血清中谷草轉氨酶（AST）濃度變化

結果顯示，在4 個時間點，模型對照組 AST濃度明顯高于空白對照組（P ＜0.05）；除了d1柴胡疏肝丸組與模型對照組相比差異不顯著（P＞0.05），其余時間點，柴胡疏肝丸組、MSCs 組和聯合用藥組 AST 濃度明顯低于模型對照組（P＜0.05）。在d7 時，聯合用藥組AST 濃度與空白對照組基本持平，差異不顯著（P ＞0.05），肝功能恢復較好（表3）。

表3 治療后大鼠肝AST 結果（±s，U/L，n=5，♂）

表3 治療后大鼠肝AST 結果（±s，U/L，n=5，♂）

注：與空白對照組比較，*P ＜0.05；與模型對照組比較，△P ＜0.05。

組別d1d2d3d7空白對照組120±12125±10 123±16122±13模型對照組297±11*232±21*204±18*180±13*柴胡疏肝丸組286±10* 211±7*△179±12*△161±11*△MSCs組244±19*△195±14*△ 172±15*△157±15*△聯合用藥組194±12*△146±14*△144±9*△136±14△

3 討論

MSCs 是存在于骨髓中具有自我增值和自我更新能力的一種成體干細胞，具有高增殖和多向分化潛能，易于采集、分離純化和體外擴增，是肝細胞重要的肝外來源[1]。在細胞治療、基因治療中具有廣泛的應用前景。近年來證實，MSCs 對急性肝損傷的修復作用，已經得到了干細胞領域和肝病學領域的公認[2]。

急性肝損傷是多因素參與的一個復雜病理過程，病變過程中多種酶、自由基以及脂質過氧化反應均發生著較大的變化，其中氧自由基對肝細胞DNA 結構及其他代謝過程有較大的影響，從而成為了急性肝損傷的重要致病因素[3]。

柴胡疏肝丸中的柴胡能疏肝氣、養肝陰，具有抗脂質過氧化作用，對保護肝細胞和恢復肝臟某些功能有一定的作用，白芍養肝柔肝，對氧自由基有清除作用[4]。這一生物學特性，使柴胡疏肝丸具有了緩解急性肝損傷病程，抑制肝損傷程度，從而具有了治療急性肝損傷的應用潛能。

綜上所述，MSCs 聯合柴胡疏肝丸對大鼠急性肝損傷進行治療，在修復肝臟組織和抑制損害程度方面實現對受損肝臟組織的修復和治療，呈現更加顯著的治療效果。