多重real-time PCR技術(shù)快速鑒別特種乳中的乳源動物成分

楊艷歌，李 莉，王丹丹，李唯熙，王洪越，劉鳴暢，吳亞君,*

（1.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176；2.河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北 邯鄲 056038）

目前乳產(chǎn)品市場朝著多樣化方向快速發(fā)展，羊乳、牦牛乳、水牛乳、駱駝乳、馬乳、驢乳等特色乳產(chǎn)品越來越受到關(guān)注。聯(lián)合國糧農(nóng)組織的數(shù)據(jù)顯示，全球生鮮乳生產(chǎn)量排名前5的分別為牛奶（占81%）、水牛奶（占15%）、山羊奶（占2%）、綿羊奶（占1%）以及駱駝奶（占0.5%）[1]。我國乳品資源豐富，加上產(chǎn)業(yè)政策的扶持，特色乳產(chǎn)業(yè)逐漸成為南方和西部地區(qū)經(jīng)濟增長的亮點。同時牦牛乳[2-3]、山羊乳[4]、驢乳[5]和馬乳[6]等乳品在營養(yǎng)素含量上更接近人乳，逐漸受到消費者青睞。

由于特色乳的數(shù)量和日產(chǎn)量較小，價格偏高[7-8]，容易發(fā)生摻假摻雜現(xiàn)象，主要是用價格相對較低的牛乳替代或添加到特色乳，這不僅侵犯了消費者的權(quán)益，而且容易引起過敏[9]等健康風險。因此各種乳源可追溯性分析方法陸續(xù)涌現(xiàn)，有基于免疫的酶聯(lián)免疫吸附劑測定技術(shù)[10-12]，基于非免疫的液相色譜[13-14]、電泳[15-17]或質(zhì)譜技術(shù)[18-20]等。而基因檢測技術(shù)是被公認的物種鑒定金標準技術(shù)，并具有可靠、特異、靈敏、快速的特點[21-23]。自發(fā)現(xiàn)牛奶中體細胞可以被用作DNA的來源后[24]，以聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）為基礎(chǔ)的乳源物種識別技術(shù)迅速發(fā)展，其中實時PCR（real-time PCR）操作簡便，無需電泳即可自動化獲得檢測結(jié)果，并進行快速定性定量分析[25-27]。而多重realtime PCR還可以在一次反應(yīng)中同時檢測多種靶點，實現(xiàn)快速高通量的檢測[21,25,28]。

本研究建立可通過一次實驗，高通量、高效率鑒別乳品中8 種乳源成分（牛、牦牛、水牛、山羊、綿羊、駱駝、馬、驢）的多重real-time PCR方法，同時篩選建立乳品DNA高效提取方法，完成裂解后在12 min左右可同時進行96 個樣品的DNA提取，大大縮短了樣品前處理時間。該方法的建立旨在為特種乳監(jiān)管提供可靠有力、快速高效的檢測手段，為打擊假冒偽劣產(chǎn)品，保障消費者生命健康提供良好的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

綿羊乳、山羊乳、駱駝乳、馬乳均從內(nèi)蒙古的牧場收集，水牛乳、驢乳、牦牛乳分別由廣西水牛研究所、山東海關(guān)和中國農(nóng)業(yè)大學提供，全脂牛乳粉由惠氏營養(yǎng)品有限公司提供。市售特色乳制品購自北京超市以及電商平臺。其他動物材料：豬、梅花鹿、馬鹿、狗、兔、狐貍、水貂、雞、鴨、魚為本實驗室儲存樣品。

1.1.2 試劑

QuickGene組織DNA提取試劑盒 日本Kurabo公司；PDQeX prepGEM通用DNA提取試劑盒 英國MicroGEM公司；NucleoSpin?食品DNA提取試劑盒 德國Macherey-Nagel公司；DNeasy Mericon DNA提取試劑盒德國Qiagen公司；Foodproof?轉(zhuǎn)基因樣品提取試劑盒德國Biotecon Diagnostics公司；TaqMan?Gene Expression Master Mix 美國Applied Biosystems公司；滅菌ddH2O。

1.1.3 引物探針

牛、水牛、牦牛、綿羊的引物探針序列引自現(xiàn)有標準[29-32]。哺乳動物、駱駝、山羊、馬、驢引物探針自行設(shè)計，先從GenBank數(shù)據(jù)庫中提取這些物種及各自近源物種的生長激素基因（growth hormone，GH）、cytb、tRNA-Thr及D-loop基因序列，然后利用Clustal X軟件進行多重序列比對，利用Primer Premier 5.0軟件在保守區(qū)域設(shè)計哺乳動物通用引物探針，在種間差異區(qū)域設(shè)計駱駝、山羊、馬、驢的特異性引物探針。考慮到乳粉在生成過程中需要經(jīng)過高溫殺菌等加工處理，會導(dǎo)致DNA斷裂或者降解，因此在設(shè)計篩選引物探針時控制靶序列長度在250 bp以內(nèi)，以保證不同加工程度乳品的檢測需求。設(shè)計的引物探針通過單重real-time PCR進行物種特異性和靈敏度進行分析，最終確定的引物探針信息詳見表1。引物探針均由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。

表1 乳源動物成分檢測引物探針信息Table 1 Information about primers and probes used for identification of dairy animal species

1.2 儀器與設(shè)備

7500fast實時熒光PCR儀 美國ABI公司；QuickGene Mini8L 日本Kurabo公司；核酸蛋白定量儀Qubit?2.0美國Invitrogen公司；組織研磨機 德國Qiagen公司；渦旋儀 德國IKA公司；Pico17離心機（離心力≥12 000×g） 美國Thermo公司；恒溫混勻儀、微量移液器 德國Eppendorf公司；離心管、八連排PCR管美國Axygen公司；電子天平 德國Sartorius公司；恒溫水浴鍋 北京六一生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

液態(tài)乳冷凍干燥成粉，乳粉直接混勻，其他植物和動物樣品統(tǒng)一用組織研磨儀粉碎，-80 ℃凍存。

1.3.2 DNA提取

CTAB法采用GB/T 19495.3—2004《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測核酸提取純化方法》[33]操作，其中蛋白酶K量增加1 倍，氯仿去蛋白的步驟重復(fù)1 次。PDQeX prepGEM通用DNA提取試劑盒按照說明書步驟提取DNA。而NucleoSpin、DNeasy Mericon、QuickGene、Foodproof DNA提取試劑盒在說明書的基礎(chǔ)上進行了改良：樣品量統(tǒng)一稱取100 mg，蛋白酶K量增加1 倍，裂解時間統(tǒng)一為65 ℃、500 r/min恒溫混勻儀振蕩孵育1 h，其余步驟按說明書操作。DNA用100 μL無菌ddH2O溶解。用Qubit?2.0測量DNA濃度，用篩選的哺乳動物內(nèi)參照基因進行DNA質(zhì)量檢測，每份DNA擴增3 次，-20 ℃保存DNA。后續(xù)實驗采用優(yōu)選的方法進行DNA提取。

1.3.3 real-time PCR擴增

單重real-time PCR體系：總體積25 μL包含12.5 μLTaqMan?Gene Expression Master Mix，10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，10 μmol/L探針0.5 μL，模板DNA 5 μL（5 ng/μL），無菌ddH2O 6 μL。

多重real-time PCR體系：4 種不同熒光的濃度為10 μmol/L的上游、下游引物和探針分別按照1∶1∶1∶1混合配制成上下游引物混合液以及探針混合液，對應(yīng)的4 種靶標乳粉DNA（5 ng/μL）等體積混合配成DNA mix。總體積25 μL包含12.5 μLTaqMan? Multiplex Master Mix，上游引物、下游引物和探針混合液各1 μL，DNA混合液5 μL，無菌ddH2O 4.5 μL。

在real-time PCR儀上進行PCR擴增與結(jié)果分析。擴增程序：50 ℃去除RNA 2 min；95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s， 60 ℃退火1 min，40 個循環(huán)（哺乳50 個循環(huán)）。生成圖像時閾值設(shè)為自動。在試樣PCR反應(yīng)的同時，設(shè)置陰性對照、陽性對照和空白對照。

1.3.4 引物探針通用性和特異性

分別以綿羊奶、山羊奶、牛乳、水牛乳、牦牛乳、駱駝乳、馬奶、驢乳、馬鹿、梅花鹿、豬、狗、兔、狐貍、水貂、雞、鴨、魚的DNA（5 ng/μL）為模板進行擴增，以無菌水為空白對照，每個樣品3 個平行。

1.3.5 多重real-time PCR交叉反應(yīng)性

按照real-time PCR儀的4 種熒光系統(tǒng)，對8 種乳源的探針分別用FAM、VIC、ABY和JUN進行熒光標記并編號，編號如表1所示。根據(jù)發(fā)光集團的不同將8 種乳源進行組合，共產(chǎn)生16 種組合：即1234、1247、1238、1278、1346、1368、1467、1678、2345、2358、2457、2578、3456、3568、4567、5678。8 種乳DNA均調(diào)至5 ng/μL，將每種組合對應(yīng)的4 種DNA進行等體積混合作為陽性（DNA終質(zhì)量濃度1.25 ng/μL），10 種陰性對照DNA調(diào)至12.5 ng/μL并進行等體積混合作為陰性對照（保證反應(yīng)體系中每個物種終質(zhì)量濃度一致），以無菌ddH2O為空白對照，進行多重real-time PCR檢測，每個樣品3 個平行。

1.3.6 多重real-time PCR絕對靈敏度

將提取的8 種乳樣品的DNA從起始質(zhì)量濃度開始進行10 倍比稀釋，稀釋6 個梯度，其中牛乳和馬乳起始DNA質(zhì)量濃度為5 ng/μL，水牛乳和驢乳起始DNA質(zhì)量濃度為10 ng/μL，牦牛乳、山羊乳、駱駝乳起始DNA質(zhì)量濃度為50 ng/μL，綿羊乳起始DNA質(zhì)量濃度為100 ng/μL。以無菌ddH2O為空白對照，用優(yōu)選的組合進行多重realtime PCR擴增，分析檢測的絕對靈敏度，每個反應(yīng)設(shè)置3 個平行。

1.3.7 實際靈敏度分析

為分析建立的多重real-time PCR體系對混合樣品檢測的靈敏度，將每種組合對應(yīng)的4 種靶標乳先等質(zhì)量混合，以非靶標乳為基質(zhì)，按照每種靶標乳含量0.1%、1%、10%、50%的比例制備混合乳品。即以綿羊乳為基質(zhì)添加牛乳/牦牛乳/水牛乳/山羊混合乳，以牛乳為基質(zhì)添加綿羊乳/驢乳/馬乳/駱駝乳混合乳，以對應(yīng)的基質(zhì)DNA為陰性對照，以ddH2O為空白對照，對目標物種成分進行多重real-time PCR檢測，每個反應(yīng)設(shè)置3 個平行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖表繪制

從儀器導(dǎo)出檢測結(jié)果和數(shù)據(jù)，并錄入在Excel表格中，在Excel中計算平均值和標準偏差，根據(jù)數(shù)據(jù)繪制三線表、柱形圖或散點圖，柱形圖用不同顏色和圖案填充，以重復(fù)實驗的標準偏差添加誤差線。擴增圖譜和標準曲線儀器自動生成，導(dǎo)出圖譜進行組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳品高效DNA提取方法的建立

為實現(xiàn)乳品DNA的快速高效提取，以牛乳和羊乳為研究對象，選用傳統(tǒng)CTAB法和5 種商業(yè)試劑盒比較和優(yōu)化DNA提取方法，通過質(zhì)量濃度、純度和哺乳動物內(nèi)參照基因檢測結(jié)果分析DNA提取質(zhì)量和擴增效率。結(jié)果顯示，針對牛乳，DNeasy Mericon DNA試劑盒提取的DNA濃度最高，其次是QuickGene組織DNA提取試劑盒，二者的擴增效率幾乎一致。針對羊乳，無論是DNA提取質(zhì)量濃度還是擴增效率，QuickGene都高于其他5 種方法。

并且QuickGene DNA組織提取試劑盒配套QuickGene-mini8L設(shè)備，通過溫和正壓過柱法從樣品中快速獲取DNA，無需離心，對核酸片段的損傷小；一次可過柱10 mL的液體，是傳統(tǒng)吸附柱法15 倍的體積量，大大縮短了富集時間，樣品裂解后12 min即可完成DNA提取；且可以一次同時處理8 份樣品，提高了提取的通量。因此最終選擇QuickGene組織DNA提取試劑盒作為不同乳制品DNA快速高效提取的方法。

圖1 不同DNA提取方法對乳DNA提取結(jié)果Fig. 1 Results of DNA extraction from milk by different DNA extraction methods

2.2 引物探針的篩選

為保證real-time PCR檢測結(jié)果的準確性，首先要保證提取的乳品DNA的質(zhì)量。因為常見的乳源物種均為哺乳動物，因此實驗設(shè)計篩選了哺乳動物通用引物探針。real-time PCR檢測結(jié)果顯示，該引物探針可以將15 種哺乳動物成分（綿羊、山羊、牛、水牛、牦牛、駱駝、馬、驢、豬、梅花鹿、馬鹿、狗、兔、狐貍、水貂）擴出，Ct值均在30以內(nèi)，非哺乳動物無擴增，表明通用性和特異性良好，可以作為乳品DNA質(zhì)量檢測的內(nèi)參照。

以8 種乳為研究對象，設(shè)計和篩選8 種乳源（牛、牦牛、水牛、山羊、綿羊、駱駝、馬、驢）的特異性引物探針（表1），擴增結(jié)果顯示只有靶標乳源物種產(chǎn)生擴增曲線，擴增Ct值在19.96～25.86之間（表2），與非靶標乳源物種之間無交叉反應(yīng)，陰性對照和空白對照也均無擴增，說明篩選的引物探針特異性較好。

表2 通用性和特異性引物探針real-time PCR檢測結(jié)果（ ）Table 2 Results of real-time PCR detection using universal and specific primers and probes ()

表2 通用性和特異性引物探針real-time PCR檢測結(jié)果（ ）Table 2 Results of real-time PCR detection using universal and specific primers and probes ()

注：a.指豬、梅花鹿、馬鹿、狗、兔、狐貍、水貂；b.指雞、鴨、魚。

樣品水牛 23.67±0.2520.39±0.28牦牛 22.93±0.5324.02±0.41山羊 22.15±0.1725.86±0.64綿羊 22.20±0.28 Ct值哺乳 牛 水牛 牦牛 山羊 綿羊 馬 驢 駱駝牛 21.24±0.0419.96±0.03 ≥40≥40≥40≥40≥40≥40≥40 20.96±0.29馬 22.32±0.22 24.43±0.35哺乳非靶標a21.43～29.18≥40非哺乳b ≥50≥40≥40 20.27±0.10駱駝 26.49±0.09≥40 20.30±0.54驢 20.07±0.11≥40≥40≥40≥40

2.3 多重real-time PCR交叉反應(yīng)性

為建立乳源多重real-time PCR檢測體系，對8 種乳源引物探針的16 種組合進行多重real-time PCR交叉反應(yīng)性檢測。結(jié)果顯示，除2358這種組合外，其他15 種組合均能成功檢測到對應(yīng)的4 個目標物種（圖2），10 種陰性對照均無擴增。但發(fā)現(xiàn)含牦牛成分的3 種組合中（1238、1346和2345）牦牛的擴增曲線ΔRn較低，非典型的S型曲線（圖2C、E和圖I）；同時1247和2457組合中山羊（圖2B和K），以及1278和2578中駱駝的擴增也出現(xiàn)同樣的現(xiàn)象（圖2D和L），說明在這8 種組合中出現(xiàn)了交叉反應(yīng)，擴增受到抑制。剩下的反應(yīng)體系中只有1234和5678這種組合可以同時保證8 種乳源均具有良好的擴增效果（圖2A和P），混合體系之間未產(chǎn)生交叉反應(yīng)，故初步確定以1234和5678這種組合作為8 種乳源多重real-time PCR檢測體系。

圖2 16種組合的多重real-time PCR擴增結(jié)果Fig. 2 Amplification curves with 16 multiplex combinations of four primers and four probes

2.4 多重real-time PCR絕對靈敏度

為對選擇的1234和5678這種組合的多重檢測體系進行絕對靈敏度分析，將8 種乳稀釋的6 個梯度進行多重real-time PCR檢測，每一個物種的擴增結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示馬乳（圖3C）、牛乳（圖3D）和駱駝乳（圖3G）DNA前5 個濃度擴增結(jié)果較好，但第6個梯度的擴增曲線接近閾值基線，故牛乳和馬乳的最低絕對靈敏度為0.5 pg/μL，駱駝為5 pg/μL；水牛乳、綿羊乳和驢乳DNA可以檢測到第6個濃度梯度，故水牛乳和驢乳的最低絕對靈敏度為0.1 pg/μL，綿羊乳最低絕對靈敏度為1 pg/μL；牦牛乳和山羊乳可以檢測到5 個濃度梯度，即最低絕對靈敏度均為5 pg/μL。分析儀器自動生成的標準曲線結(jié)果，如圖4所示，R2均在0.99以上，擴增效率均在80%以上，說明線性關(guān)系良好，檢測結(jié)果較可靠。

圖3 8種乳源多重real-time PCR絕對靈敏度擴增圖譜和數(shù)據(jù)分析Fig. 3 Amplification curves showing absolute sensitivity of multiple real-time PCR for detection of milks from eight dairy species

圖4 8種乳源多重real-time PCR絕對靈敏度標準曲線結(jié)果Fig. 4 Standard curves for absolute sensitivity of multiple real-time PCR for detection of milks from eight dairy species

2.5 多重real-time PCR檢出限

為了進一步分析1234與5678組合的多重realtime PCR體系對混合乳品檢測的實際靈敏度，制備了4 種目標乳含量為0.1%、1%、10%、50%的混合樣品，多重real-time PCR檢測結(jié)果顯示8 種乳的檢出限均可達0.1%，檢測Ct值在32.05～38.07之間（圖5），可以滿足檢測需求。因此確定后續(xù)實際乳品檢測以1234與5678這種多重real-time PCR體系進行乳品中8 種乳源成分的檢測。

圖5 混合乳品多重real-time PCR實際檢出限Fig. 5 Limits of detection of multiplex real-time PCR for milk mixtures

2.6 市售樣品檢測結(jié)果

用建立的方法對55 份樣品市售特色乳產(chǎn)品進行了乳源成分分析，包括12 份牦牛乳制品、4 份水牛乳制品、11 份駱駝乳制品、4 份馬乳制品、5 份驢乳制品、9 份山羊乳制品、6 份綿羊乳制品以及4 份未標識羊品種的羊乳制品。種類包括液態(tài)鮮奶、酸奶、奶貝/奶片、奶酪/干酪、奶粉、嬰配，涉及的加工方式包括巴氏殺菌、發(fā)酵、高溫滅菌、超高溫滅菌、高溫噴霧干燥、物理脫膻、凍干、低溫干燥、低溫干濕復(fù)合等。用哺乳動物內(nèi)參照進行DNA質(zhì)量檢測，結(jié)果顯示所有乳制品檢測Ct值均在35以內(nèi)，證明建立的DNA提取方法可以滿足不同種類不同加工方式乳制品基因檢測的需求。多重realtime PCR進行8 種乳源成分的檢測結(jié)果顯示（表3），有20 份乳制品檢出非標識物種成分，摻偽率達36.36%，主要是羊乳制品、駱駝乳制品及牦牛乳制品。其中5 份山羊乳制品檢出非標識綿羊或牛成分，不符率為55.56%；3 份綿羊乳制品檢出非標識山羊或牛成分，不符率為50%；另有1 份馬乳制品、1 份驢乳制品、6 份駱駝乳制品、4 份牦牛乳制品檢出非標識牛成分，不符率分別為25%、20%、54.54%、33.33%。水牛乳制品和未標識品種的羊乳制品未檢出非標識成分。整體市售特色乳產(chǎn)品乳源標識不符率達36.36%。

表3 市售乳及乳制品乳源動物物種成分檢測Table 3 Results of detection of animal-derived ingredients from commercial dairy products from minor species

續(xù)表3

3 討 論

分離提取高質(zhì)量的DNA是基因檢測的首要原則，從乳品中提取DNA主要從體細胞中獲得，而每毫升乳中僅有20～20萬 個體細胞，DNA含量不高[24,34]。加之乳制品在生成過程中需要經(jīng)過噴霧干燥、高溫殺菌等加工處理，會導(dǎo)致DNA斷裂或者降解，加劇了DNA提取的難度[35]。因此建立乳品中高效快速的DNA提取方法，對乳品的乳源檢測具有重要意義。通過比較，QuickGene DNA提取試劑盒不僅半自動、高通量，且相比于傳統(tǒng)試劑盒法具有以下優(yōu)點：1）移液快，具有10 mL容量的富集柱遠高于傳統(tǒng)富集柱650 μL的容量；2）DNA損傷小，即用正壓過濾而無需高速離心；3）損失少，即1 次過柱即可完成過濾，而傳統(tǒng)試劑盒需多次轉(zhuǎn)移。另外乳品蛋白質(zhì)含量高，這不僅給DNA提取帶來困難，也會抑制PCR，降低檢測的靈敏度[36-37]，蛋白酶K可以水解消化蛋白質(zhì)，因此提高了蛋白酶K的濃度和作用時間以增強水解作用。但水解時間過長，又會導(dǎo)致部分核酸消耗；過高濃度的蛋白酶K也會引起部分核酸的消耗，增加不必要的實驗成本[38]。因此經(jīng)過優(yōu)化（數(shù)據(jù)未提供），普通乳品蛋白酶K的用量提高至試劑盒濃度高2 倍；奶酪制品蛋白酶K用量是試劑盒濃度3 倍時效果最好，該方法保證了后續(xù)實驗中不同種類不同加工方式乳制品DNA的成功提取，說明了優(yōu)化方法對于乳制品的適用性。

本研究設(shè)計篩選的8 種乳源物種探針采用TaqMan QSY標記，該方法的優(yōu)點是可將已進行單重realtime PCR篩選后的探針，在不改變序列的情況下直接平移到QSY探針上，減少了傳統(tǒng)多重real-time PCR探針設(shè)計和篩選的工作量。且采用該體系，設(shè)計的引物探針既可進行單重也可進行多重real-time PCR檢測。同時5′熒光基團為FAM、VIC、ABY、JUN，避免了黯淡的染料Cy5或Quasar 705熒光信號低，靈敏度低的情況。本研究還采用了TaqMan? Multiplex Master Mix多重real-time PCR擴增酶，該酶采用MUSTANG PURPLE染料作參比熒光而不含ROX，可避免占據(jù)PCR儀紅色熒光通道，提高了反應(yīng)的靈敏度。最終通過實驗證實該方法特異性好、靈敏度高，檢測核酸含量可達pg級。

采用建立的多重real-time PCR法，對55 份市售的乳品進行物種來源檢測，發(fā)現(xiàn)嬰幼兒配方粉普遍存在乳源標識不符的情況，達到85.7%。除了蓄意摻假，標識以外物種成分的來源還可能是乳糖等配料。本實驗室采用real-time PCR法對牛來源的乳糖檢測到明顯的陽性信號（結(jié)果未發(fā)表）。因此，當應(yīng)用real-time PCR法檢測乳品動物來源時，對于成分復(fù)雜的產(chǎn)品，可以考慮進一步使用蛋白質(zhì)分析方法確證動物成分是否來源原料乳。本實驗室也建立了乳源蛋白雙向電泳檢測方法[39-40]，可通過圖譜直觀地呈現(xiàn)乳品中主要蛋白質(zhì)，但蛋白分析方法操作步驟復(fù)雜、比較耗時、靈敏度相對較低。因此，多重real-time PCR法作為高效篩查技術(shù)，可以應(yīng)用于含有其他動物來源成分產(chǎn)品的快速篩選，對具體成分可以通過電泳、色譜、質(zhì)譜等技術(shù)進一步鑒定，從而提高檢測效率和準確性。