不同產地三文魚的穩定同位素指紋特征及原產地溯源

吳 浩，周秀雯,2，陳海泉，靳保輝，顏 治，趙 旭，謝麗琪，趙 燕，林光輝

（1.深圳海關食品檢驗檢疫技術中心，廣東 深圳 518054；2.中國計量大學生命科學學院，浙江 杭州 310018；3.中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，北京 100081；4.清華大學深圳國際研究生院，廣東 深圳 518055；5.清華大學地球系統科學系，北京 100013）

“三文魚”是一種商業名稱，包括鱒魚（三文鱒、金鱒）和鮭魚（大西洋鮭，太平洋鮭，北極白點鮭和銀鮭）等[1]。我國進口的“三文魚”主要是指大西洋鮭魚（Salmo salar）[2]。隨著我國經濟的發展，國民對進口水產品的消費量逐年提高，三文魚市場需求量也隨之日益增加，預計2025年中國大西洋鮭魚的消費量將會達到24萬 t[3]。市場上大西洋鮭魚由于主要以切片的形式出售，因此無法獲取準確的來源信息。因此，開發進口水產品產地識別技術，開展污染水產品的溯源研究，對提高進口口岸的水產風險管控能力以及回應輿論關注都具有重要意義。

穩定同位素技術是目前食品真實性和產地判別研究的主要技術之一[4]。穩定同位素具有指示、整合以及示蹤的能力，可實現不同類型食品的原產地識別，具有廣闊的應用前景[5]。目前的穩定同位素技術在三文魚產品領域主要集中在對其生活史溯源、有機和非有機產品的鑒別等[6]。Doucett等[7]于1996年采用碳、氮穩定同位素發現養殖的三文魚幼年時期85%左右的食物來源于外來環境，成年后三文魚的營養等級比幼年時高了2.5 個營養級。Johnson等[8]的研究比較了不同品種三文魚的食物來源，從而判斷三文魚棲息地的食物結構。Turchini等[9]也報道了采用氧穩定同位素可以判斷三文魚的養殖水域。另外，Molkentin等[10]報道用同位素區分野生和養殖三文魚。以上研究結果都表明，穩定同位素技術可對三文魚食物來源、水源地和生產方式進行有效識別。

我國對大西洋鮭魚的產地真實性目前沒有明確的鑒別標準。對三文魚產地的研究最早采用電子標簽溯源。歐盟2002年頒布了關于魚類溯源的法規“Regulation 178/2002”[11]，該法規定義了“從農田到餐桌”的溯源體系。電子標簽作為一種有效的溯源方法已經被開發出來[12]，隨著擴增片段長度多態性技術和數據庫技術的結合，極大地促進了水產品的電子溯源技術的發展[13]。然而，該技術由于成本高，且不能有效提高生產商的利益，導致生產商沒有使用此技術的積極性[14]。也有通過對魚鱗形態分析以識別魚類產地的報道，但該方法不是主流的研究方法，且難以標準化[15]。最新的研究報道了基于物聯網的三文魚真實性的判別系統[5]，但該技術也存在費用高、需要多方協調以及面臨標簽造假的隱患[14]。因此，進口大西洋鮭魚的產地識別仍然缺乏有效的鑒別技術手段以捍衛我國進口水產品的貿易秩序。綜上，針對終端產品的產地溯源技術可有效提高監管效率，降低企業的管理成本，也更容易推廣。本研究比較來自世界6 個主要產地的三文魚產品中穩定同位素化學指紋特征，以期為構建快速、可靠的三文魚進口產品的產地追蹤技術提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

USGS 43、USGS 54、USGS 56穩定同位素固體標準物質，元素含量標準物質磺胺嘧啶 美國Thermo Fisher公司；IAEA-CO8液體標準物質 維也納國際原子能機構；磷酸（優級純） 德國默克公司；大西洋鮭魚實驗樣品15～20 條，法羅群島、挪威、加拿大、澳大利亞以及智利共5 個進口產地，每個產地采購3～4 條，且每條魚均來自不同漁場；虹鱒（Oncorhynchus mykiss）2 條中國青海龍羊峽水庫；大西洋鮭魚驗證樣品（原產地為智利3 份（每份500 g）、挪威2 份（每份200 g）、加拿大1 份（每份200 g）） 深圳市海鮮超市。詳細樣品信息見表1。

表1 本研究采集到進口和國產三文魚實驗樣品的詳細信息Table 1 Detailed information about imported and domestic salmon collected in this study

1.2 儀器與設備

HT 2000元素分析儀、Delta V Advantage穩定同位素比率質譜儀、銀杯、錫杯 美國Thermo Fisher公司；XS3DU百萬分之一電子天平 瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

所有三文魚樣品整魚取背脊、肌肉、鱗片、脊椎骨以及表皮組織作為研究對象。分別取肌肉、表皮約20 g勻漿后放入50 mL離心管，加入30 mL正己烷，充分振蕩后去脂，60 ℃烘干后研磨，過80 目篩。鱗片用去離子水清洗后烘干、研磨；脊椎骨剔除肌肉，取背脊處5 節，放入50 mL離心管加入20 mL正己烷去除油脂，60 ℃烘干后研磨，過80 目篩。

1.3.2 穩定同位素比值分析方法

樣品的碳、氮、硫穩定同位素比值和含量采用耦合元素分析儀與穩定同位素比率質譜儀分析。用百萬分之一電子天平準稱取約2 mg樣品用錫杯包裹備測。元素分析儀條件為：燃燒爐溫度1 020 ℃，通氧時間3 s，流速250 mL/min，氦氣流速50 mL/min。在元素分析儀中，樣品的碳、氮、硫元素被分別氧化成CO2、N2以及SO2。色譜柱溫70 ℃，待CO2和N2出峰后，將溫度升至240 ℃加快SO2的出峰速度。同位素標準品采用USGS 43（δ13CV-PDB=-21.28‰、δ15NAir=+8.44‰、δ34SV-CDT=+10.46‰）作為質控用于碳、氮、硫穩定同位素分析。采用磺胺嘧啶（C=41.81%、N=16.25%、S=18.62%）作為碳氮硫含量的質控樣品，每8 個樣品插入1 個標準物質用于漂移校正。碳、氮、硫的穩定同位素比值測試精度分別為0.1‰、0.2‰、0.4‰。

氫、氧同位素采用穩定同位素比率質譜儀分析。稱取約0.3 mg樣品用銀杯包裹后放入樣品盤，然后將樣品盤整體放入干燥器中干燥24 h，以降低空氣中水分的影響。高溫裂解分析方法的條件：燃燒爐溫度1 400 ℃，色譜柱溫80 ℃，氦氣流速110 mL/min，進樣器吹掃流速200 mL/min。樣品的氫氧元素經過裂解管高溫裂解后在碳環境中生成H2和CO，并通過He流送入質譜分析氫、氧的穩定同位素比值。穩定同位素標準品采用USGS 43（δ2HV-SMOW=-50.3‰、δ18OV-SMOW=+14.11‰）、USGS 54（δ2HV-SMOW=-150.4‰、δ18OV-SMOW=+17.79‰）、USGS 56（δ2HV-SMOW=-44‰、δ18OV-SMOW=+27.23‰）作為質控用于氫、氧穩定同位素的數據校正。氫、氧穩定同位素長期的實驗室分析精度分別為1.2‰、0.3‰。

骨骼樣品的碳酸鹽碳、氧同位素比值采用水平衡-穩定同位素比率質譜法（gas bench-IRMS）分析。將1 mg骨骼樣品加入12 mL具塞玻璃瓶中，用He吹掃5 min去除頂空空氣，加入1 mL磷酸。在99 ℃水浴4 h后置入恒溫樣品盤內，再用Gasbench-IRMS系統測定生成CO2的碳、氧同位素比值。采用IAEA-CO8標準品作為質控標準（δ13CV-PDB=-5.76‰、δ18OV-SMOW=-22.7‰），每8 個樣品插入一個標準物質用于儀器漂移校正。碳酸鹽碳、氧穩定同位素比值測試精度分別為0.2‰、0.3‰。

1.4 數據處理

采用單因素方差分析用于分析骨骼中碳氧穩定同位素比值（取絕對值對數）的產地差異，SNK作為事后多重比較方法。雙因素方差分析（two way-analysis of variance，two way-ANOVA）用于分析三文魚不同組織以及不同產地的穩定同位素比值和元素含量的差異。近年來，產地溯源的模型算法越來越多樣化，常見的有：基于無監督的主成分分析（principal component analysis，PCA）、聚類分析（clustering analysis，CA）、隨機森林模型（random forest，RF）；基于有監督的判別分析（discriminant analysis，DA）、人工神經網絡（artificial neural network，ANN）、支持向量機（support vector machines，SVM）等。而DA是應用最為廣泛的產地溯源方法，包括偏最小二乘法判別（partial least squares，PLS-DA）以及正交偏最小二乘法（orthogonal partial least square method，OPLS-DA）。DA作為一種多元統計方法已經在多種食品以及農產品的產地溯源中取得良好的應用效果[16]。該模型已經在大量產品溯源案例中（酒類[17]、乳制品[18]、肉制品[19]、農產品[16]以及中藥材[20]）得到成功應用。本研究采用DA對不同產地三文魚進行區分，并分別對不同部位穩定同位素比值對產地的識別能力進行評估。對不同產地三文魚的表皮、骨骼、鱗片以及肌肉的同位素分別進行DA，其中骨骼樣品還加入骨骼中無機碳酸鹽的碳、氧同位素比值。所有統計分析方法采用SPSS 22軟件進行分析。采用Origin pro 2018軟件繪制圖形。

2 結果與分析

2.1 有機質穩定同位素比值

5 個國外產地和我國1 個產地的三文魚骨骼、表皮、肌肉和鱗片有機質穩定同位素組成分析結果如圖1。三文魚不同產地不同部位的碳穩定同位素比值（δ13C）分布范圍為-24.96‰～-16.93‰，氮穩定同位素比值（δ15N）分布范圍為5.75‰～9.64‰，硫穩定同位素比值（δ34S）分布范圍為2.08‰～12.24‰。從不同部位看，δ13C值大小順序為鱗片＞表皮，肌肉和骨骼的δ13C均低于鱗片和表皮，除中國虹鱒外，其他產地的肌肉和骨骼的δ13C差異不大，且不同產地比值大小不同，如CA、NW和CHL產地的肌肉δ13C值大于骨骼的對應值，其他產地則反之（圖1a）。而δ15N呈現“肌肉＞鱗片＞表皮＞骨骼”的趨勢，不同組織的δ34S值差異不顯著（表2）。整體而言，加拿大、智利和中國的虹鱒碳穩定同位素比值高于其他產地（圖1a），加拿大以及法羅群島氮穩定同位素比值高于其他產地（圖1b），δ34S表現出顯著的產地差異（圖1c），但不同組織間差異不顯著（表2）。

三文魚有機質的氫穩定同位素比值（δ2H）變異較大，介于-20‰～-140‰之間（圖1d），且顯現出明顯的組織間差異，表皮和鱗片的δ2H顯著高于骨骼和肌肉。氧穩定同位素比值（δ18O）于3‰～18‰波動，且表現出較好的產地差異（圖1e）。中國虹鱒的肌肉中δ18O最高達到17.79‰。除肌肉外的其他部位，中國的虹鱒具有最低的氧穩定同位素比值，其次為加拿大，其他4 個產地氧穩定同位素比值無明顯變化趨勢。雙因素方差分析自由度，統計量（F值）評估組間差異等數據，F值越大，表示方程越顯著，擬合程度越好。由表2可知，三文魚不同組織以及不同產地的δ2H和δ18O均具有顯著差異。

表2 不同產地三文魚、不同部位穩定同位素和含量的雙因素方差分析Table 2 Two way-analysis of variance (ANOVA) of stable isotopes and contents in salmon from different geographical origins and in different tissues

圖1 不同產地三文魚骨骼、表皮、肌肉和鱗片中碳（a）、氮（b）、硫（c）、氫（d）、氧（e）穩定同位素比值分布Fig. 1 Stable isotope ratio distribution of carbon (a), nitrogen (b),sulfur (c), hydrogen (d) and oxygen (e) in bones, skins, muscles and scales of salmon from different geographical origins

2.2 有機質碳、氮、硫元素含量

三文魚不同組織碳、氮、硫含量差異較大（圖2），因為肌肉和鱗片有交叉，且在CA、FL、CHL和AU產地中，其肌肉、鱗片的氮元素含量幾乎相等，因此將氮元素含量中肌肉和鱗片歸為一類表示為肌肉、鱗片。三文魚中表皮、肌肉的碳含量，鱗片、表皮的硫含量同理。氮含量呈現“骨骼＜肌肉、鱗片＜表皮”的趨勢，骨骼、肌肉、鱗片、表皮平均值分別為8.3%、23.1%、24.6%、34.0%；碳含量呈現“骨骼＜鱗片＜表皮、肌肉”的趨勢，骨骼、鱗片、表皮、肌肉平均值分別為31.1%、37.7%、56.2%、62.2%；硫含量呈現“骨骼＜鱗片、表皮＜肌肉”的趨勢，骨骼、鱗片、表皮、肌肉平均值分別為0.25%、0.50%、0.53%、0.72%。除了碳含量以外，氮、硫元素含量均未表現出顯著的產地間差異（表2）。由圖2可以看出，肌肉和鱗片的氮含量，肌肉和表皮的碳含量的分布趨勢表現出不同的產地差異。單因素方差分析表明，肌肉/鱗片的氮元素含量（P=0.016）以及肌肉/表皮的碳元素含量（P=0.006）具有顯著的產地差異。

圖2 三文魚不同部位氮（a）、碳（b）、硫（c）含量Fig. 2 Nitrogen (a), carbon (b), and sulfur (c) contents in different tissues of salmon

2.3 骨骼碳酸鹽碳、氧同位素比值

三文魚骨骼碳酸鹽的δ13C值范圍-8.72‰～-6.31‰，其平均值為-7.29‰。δ18O范圍-21.23‰～-17.14‰，其平均值為-19.47‰（圖3）。整體而言，不同產地三文魚的骨骼碳酸鹽碳、氧同位素差異不顯著（表2）。澳洲三文魚骨骼δ13C顯著低于其他產地（P＜0.05），而中國虹鱒骨骼的δ18O低于其他產地。

圖3 不同產地三文魚骨骼碳酸鹽的碳、氧穩定同位素的分布Fig. 3 Distribution of carbon and oxygen stable isotopes in bone carbonates of salmon from different geographical origins

2.4 三文魚產地溯源與驗證

所有三文魚組織的穩定同位素以及含量數據的DA結果顯示，6 個產地（包括5 個進口和1 個國產）的三文魚可以全部區分開（圖4）。法羅群島和挪威的三文魚樣品分布比較接近，這主要是由于挪威和法羅群島在地域和氣候上均非常接近，說明同位素對地理差異的指示性非常好，可用于水產品的產地溯源。除此之外，中國的虹鱒也能與其他三文魚產地樣品實現區分。但由于本研究樣品數量有限，未能包括所有子產地樣品，所以該準確率僅代表本數據集的判別結果。

圖4 不同國家三文魚樣品的產地DAFig. 4 DA plot for discrimination of salmon samples from different geographical origins

為了簡化數據結構的復雜度，便于實際應用，本研究還分析了三文魚不同組織和同位素比值的產地判別效率（表3）。對于同位素分析而言，現有的穩定同位素分析技術可在單次分析中取得δ13C、δ15N、δ34S或者δ2H與δ18O對其產地溯源，為了最小化分析測試的時間以及成本，分不同部位以及不同指標進行DA。結果表明，表皮、鱗片、骨骼的碳、氮、硫同位素可將5 個產地樣品完全區分。如果只能取得三文魚樣品的肌肉，還需要氫、氧的同位素指標，才能達到較好的區分效果。單獨采用氫、氧同位素分析則不能獲得滿意的區分效果。在實際的應用中，由于三文魚的骨骼一般比較難獲取，因此采用表皮、鱗片的碳、氮、硫同位素比值可獲得最佳的產地判別效率。考慮到取鱗片不會破壞樣品的經濟價值，是一種無損的采樣方法，可滿足高價值水產品的采樣需求。

表3 三文魚不同組織以及不同同位素的產地判別結果比較Table 3 Results of discriminant analysis of salmon from different geographical origins based on stable isotope indicators in different tissues

市場上三文魚主要以切塊的形式銷售，多數情況下樣品僅包含鱗片、表皮以及魚肉。因此在實際應用過程中以鱗片、表皮以及肌肉等較易獲取的部位作為分類指標，按照前述方法進行處理，分別分析不同組織樣品的碳、氮、硫、氫、氧的穩定同位素比值。采用DA對中國、法羅群島、澳洲、挪威、加拿大、智利共6 個國家的真實樣品以及驗證樣品（T-加拿大、T-智利、T-挪威）的區分如圖5所示。智利和加拿大樣品被正確判斷，而6 個挪威三文魚樣品有2 個被錯誤判斷為智利產地樣品。挪威、法羅群島等高緯度冷水區域養殖的三文魚由于脂肪含量高、口感好被消費者喜愛。因此，零售市場可能存在其他產地三文魚冒充挪威和法羅群島三文魚的情況。

圖5 市場購買的三文魚產品與原產地產品穩定同位素指紋特征DA結果比較Fig. 5 Comparison of results of discriminant analysis of stable isotope finger characteristics between authentic and purchased salmon

3 討 論

3.1 三文魚不同部位的同位素分餾效應

魚類生長過程需要的碳、氮、氫、氧、硫的穩定同位素均來自攝入食物的同化過程，動物機體在食物的同化過程會受到不同酶體系的作用，因此發生不同程度的動力學非平衡分餾[21]。三文魚是雜食性魚類，商業化的三文魚飼料主要由豆粕、蔬菜等植物性原料以及魚粉等動物性原料組成。食物源性的差異可能導致不同產地三文魚具有較為明顯的同位素差別。研究表明，動物的肌肉組織對食物的碳穩定同位素分餾效應比較小，約發生0‰～1.0‰的分餾[22]，而氮的穩定同位素比值相對于食物的分餾系數約3.0‰～5.0‰，常被用于不同營養級關系的區分[21]，三文魚肌肉的δ15N對于飼料的中氮同位素分餾系數約在2.5‰～3.5‰之間[7]。由于缺乏不同國家飼料配比的信息，不同組織同位素比值無法與食物來源進行比較，但可與肌肉的分餾效應進行比較，考察不同組織之間的分餾效應差異。本研究結果表明，表皮和鱗片均具有相對偏正的碳、氫的穩定同位素比值，相比其他組織具有更大的碳、氫同位素分餾效應。相對于肌肉組織，表皮、鱗片的碳同位素分餾效應分別達到2‰、4‰；表皮、鱗片的氫穩定同位素的分餾效應達到約80‰、100‰，而硫的分餾效應不明顯。

魚類表皮是一種特殊的組織，負責對損傷的修復，分泌黏液等個體保護功能[23]，處于非常活躍的生物代謝活動狀態。而鱗片可認為是角質化的表皮[24]，且鱗片等角質化的組織形成后基本不與體內發生同位素交換，因此可以整合三文魚整個生長周期的同位素信號。已有研究表明，鱗片與肌肉的碳、氮穩定同位素比值具有較好的相關性[21]。Pearson相關系數越接近于1或-1，相關度越強；反之，則越弱。本研究肌肉和鱗片碳、氮、硫穩定同位素的Pearson相關系數分別為0.75、0.84和0.99，3 種同位素均具有極顯著的正相關關系（P＜0.01），鱗片可代替肌肉作為產地溯源的指標。魚類在不同的生長環境可能會導致表皮對環境的不同響應，從而引起不同的分餾效應。魚類表皮的穩定同位素可能在一定程度上反映了產地環境的差異。因此，魚類表皮以及鱗片可以綜合反映魚類的生存環境和飼料的差異。

三文魚骨基質是由無機質的磷酸鈣和碳酸鈣沉積在有機膠原基質中形成的[25]。而碳酸鹽主要存在于磷灰石晶格中[26]。動物骨骼種碳酸鹽的形成與血液中碳酸氫鹽的沉積有關[27]，在魚骨骼中的含量約為5%～6%。因此其碳、氧同位素主要與血液中碳酸氫鹽的來源有關，且不能完全由食物來源解釋[27]，可能還與水體中的碳酸鹽密切相關，需要進一步研究骨骼中碳酸鹽的碳、氧同位素比值與水環境之間的關聯性，便于闡明骨骼碳酸鹽對產地的指示原理。

3.2 產地環境對三文魚同位素比值的影響

雙因素方差分析結果顯示，穩定同位素比值在產地間均具有極顯著差異（P＜0.01），魚皮和肌肉的硫含量，骨骼的碳含量具有顯著差異（P＜0.05），表明穩定同位素可有效識別三文魚產地（表2）。對于碳、氮同位素而言，三文魚產地的差異主要體現在飼料的差異上，其次三文魚養殖過程中飼料以外的食物來源也對可能對其穩定同位素比值產生影響，研究表明遠海區系的δ13C比淡水輸入的河口區系更偏正[28]。本研究中法羅群島與挪威產地的地理位置和緯度上均非常接近，而法羅群島三文魚的碳、氮、硫的穩定同位素比值均高于挪威產地三文魚的對應同位素比值，變化趨勢相同。可能原因是挪威產地處于多條內陸河流影響，法羅群島養殖區域更接近于遠海，因此除了飼料的差別外，養殖區域受到陸源的影響也可能是導致同位素差異的原因之一。研究表明，水生動物組織中的氫、氧的穩定同位素主要受到環境水體影響[29-30]。Chesson等[31]的研究也表明，陸地和水生動物蛋白的氫、氧同位素比值主要由食物和環境水（包括飲用水）共同決定，同一水域的不同動物組織具有相近的氫、氧同位素比值，因此三文魚蛋白中的氫、氧同位素比值可以反映水源的差異[9]。所以挪威產地三文魚中氧穩定同位素比值較低的原因可能受到當地氧同位素比值偏低的水源影響。中國虹鱒養殖于青藏高原，由于青藏高原湖泊水域的氧同位素比值偏低，因此中國虹鱒除肌肉外的部位氧穩定同位素比值均低于其他產地，除肌肉外的部位，氧穩定同位素比值均為所有產地最低。因此可以說明環境水體可影響三文魚表皮、骨骼以及鱗片等生長緩慢部位的氧穩定同位素比值。肌肉由于合成旺盛，其氧同位素比值主要受飼料的影響。

從產地看，加拿大樣品δ34S最低，法羅群島最高，其他產地差別較小。硫穩定同位素指示了三文魚飼料中陸地來源和海洋來源飼料的比例，研究表明陸地生態系統中硫穩定同位素比值低于海洋來源。不同部位之間的δ34S差異較小，部分產地（澳洲、加拿大）表現出較為明顯的“骨骼＞鱗片＞肌肉和表皮”趨勢，表明硫同位素在動物生長過程中的角質化和骨骼形成過程中具有輕微的分餾現象。

4 結 論

采用多元素穩定同位素分析技術結合多元判別模型，可實現我國主要三文魚進口產地的判別，且能將中國的虹鱒與三文魚進行區分。在實際應用中，由于三文魚的骨骼一般比較難獲取，因此采用表皮、鱗片的碳、氮、硫共3 種同位素比值可獲得最佳的產地判別效率。由于取鱗片不會破壞樣品的經濟價值，因此這是一種無損的采樣方法，可滿足高價值水產品的采樣需求。魚鱗和魚皮的穩定同位素比值與產地環境相關，作為產地溯源指標優于肌肉。雖然本研究的數據量有限，產地溯源的可靠性和穩定性還需要大量收集樣品以進一步驗證此方法的準確性，但本研究建立的方法可為鑒別市場上三文魚的真實性和溯源產地提供新的技術思路。在新冠肺炎持續肆虐全球的背景下，本研究的方法也有助于我國衛生檢疫部門對新冠病毒污染食品的溯源工作提供技術支撐。