原位合成銅基金屬有機框架差分脈沖伏安法快速檢測肉制品中亞硝酸鹽

徐藝偉，朱 丹，石吉勇，張 文，王 鑫，劉 超，李文亭，鄒小波

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013）

亞硝酸鹽作為食品添加劑，被廣泛應用于培根、火腿和香腸等肉制品中，具有發色、防腐和增強風味的作用[1]。亞硝酸鹽被人體攝入，在胃酸環境中，能夠與體內的胺類物質作用，生成亞硝基化合物[2]，該化合物是強致癌物質[3]。當亞硝酸鹽經消化道吸收進入血液，能夠將低鐵血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白，降低血紅蛋白運輸和釋放氧的功能，導致組織缺氧，形成高鐵血紅蛋白血癥[4]。國內外對于肉制品中亞硝酸鹽的含量都有嚴格限制，亞硝酸鹽含量是肉制品衛生檢疫中必檢項目。因此，開發肉制品中亞硝酸鹽的快速檢測方法，對于保障消費者食用安全具有重要意義。

食品中亞硝酸鹽檢測方法主要有分光光度法[5]、色譜法[6]、毛細管電泳法[7]、電化學法等[8]。其中，電化學方法具有設備便攜、操作簡單、響應速度快等優勢[9]，在亞硝酸鹽檢測中具有廣闊的應用前景[10]。NO-2中的氮原子化合價為正3價的中間價態，既有還原性又具備強氧化性，能夠在電位作用的同時，在電極表面發生電子轉移[11]。在低電位作用時，NO-2可以獲得電子，發生還原反應生成NO；在高電位作用時，NO-2將失去電子，發生氧化反應生成NO2[12]。依據電子轉移所產生的電流信號，可實現NO-2濃度的測定[13]。基于NO-2的反應原理，在電極表面修飾具有催化NO-2氧化或還原的功能性材料，可有效增強電流信號，提高傳感器的靈敏度[14]。辣根過氧化物酶可催化NO-2氧化，常被用于開發電化學傳感器[15]。然而，由于酶的生物屬性，這些傳感器的性能往往受到酶活性和穩定性的限制[16]。

金屬-有機骨架材料（metal-organic frameworks，MOFs）是金屬離子與有機配體通過自組裝形成的具有三維結構的晶體材料[17]。近年來，MOFs材料被發現具有模擬酶活性[18]，與天然酶相比具備許多獨特優勢，如催化性能穩定、不易失活、成本低廉、易保存等[19]。MOFs材料的合成方法主要包括水熱法、機械法、擴散法、微波輔助法以及電化學法等[20]。其中電化學合成法能夠在電極表面原位生成目標產物[21]，無需使用黏合劑固定，方便用于電化學傳感器的構建[22]。

本實驗通過電化學法原位合成銅基金屬有機框架（Cu-based metal organic frameworks，Cu-MOFs），制備用于肉制品中亞硝酸鹽檢測的電化學傳感器。首先，采用電沉積方法在玻碳電極（glassy carbon electrode，GCE）表面修飾1 層致密且均勻的銅膜；然后，利用堿性氧化作用，將電極表面的銅轉化為Cu(OH)2；最后，使用交聯劑將Cu(OH)2轉化為Cu-MOFs。電化學原位合成方法制備Cu-MOFs具有反應速度快、反應條件溫和、化學試劑消耗少等優勢。Cu-MOFs能夠催化NO-2氧化，可有效增強NO-2的電流信號。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

硫酸銅、硫酸銨、過硫酸銨、氫氧化鈉、無水乙醇、1,3,5-苯三甲酸（1,3,5-benzenetricarboxylic acid，H3BTC）、磷酸鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、三水亞鐵氰化鉀等試劑（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；亞硝酸鹽標準溶液（質量濃度100 mg/L） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

CHI600D電化學工作站、GCE（直徑3 mm）、Ag/AgCl電極、鉑絲電極 上海辰華儀器有限公司；JSM-7001F場發射掃描電子顯微鏡 日本Jeol公司；BSA224S-CW分析天平 德國Sartorius公司；微量移液器 德國Eppendorf公司；KQ-100KDE型超聲清洗器昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 電化學傳感器制備

電極預處理：將GCE依次用粒徑為1.00、0.30、0.05 μm的氧化鋁粉末，在拋光絨布上拋光呈鏡面，然后在無水乙醇和去離子水中分別超聲處理5 min清除殘留的氧化鋁，并用氮氣吹干備用。

電沉積制備Cu/GCE[23]：分別稱取0.000 1 mol的硫酸銅和0.005 mol的硫酸銨放入同一燒杯中，加入10 mL的水溶解，配制電解質溶液。將預處理的GCE作為工作電極，浸入10 mL已經配制好的電解質溶液中，在-0.3 V（vsAg/AgCl）的恒電位中保持400 s。在該過程中，溶液中的銅離子在電位作用時被還原為銅單質而沉積在電極表面，形成1 層均勻、致密且附著性好的銅膜，由此獲得Cu/GCE。

Cu/GCE轉變為Cu(OH)2/GCE[24]：將Cu/GCE浸入濃度3 mol/L的氫氧化鈉溶液，并施加0.2 mA的恒定電流保持180 s。在該過程中，電極表面的銅在堿性氧化作用中轉變為Cu(OH)2，獲得Cu(OH)2/GCE。

Cu(OH)2/GCE轉變為Cu-MOFs/GCE[25]：稱取0.1 g的H3BTC與4.7 mL無水乙醇和1.8 mL的去離子水混合，超聲處理5 min，配制交聯劑溶液。將Cu(OH)2/GCE浸入到交聯劑溶液中保持240 s，電極表面的Cu(OH)2在交聯劑H3BTC的作用中轉變為Cu-MOFs，獲得Cu-MOFs/GCE。

1.3.2 電化學檢測NO-2

通過差分脈沖伏安法（differential pulse voltammetry，DPV），以0.1 mol/L的磷酸緩沖溶液（pH 7）為電解質，獲得NO2-的電流信號[26]。DPV參數：初始電位0.3 V，終止電位1.2 V，步進電位5 mV，振幅0.05 V，脈沖寬度0.05 s，采樣寬度0.016 7 s，脈沖周期0.05 s。

采用循環伏安（cyclic voltammetry，CV）法分別設置不同的掃描速率（20、40、60、80、100 mV/s），觀察NO-2在Cu-MOFs/GCE表面的電化學行為。CV電位范圍為0.3～1.2 V，NO2-的濃度為100 μmol/L，電解質為0.1 mol/L的磷酸緩沖溶液（pH 7）。

1.3.3 電極的選擇性和穩定性

選擇食品中常見的離子（包括Na+、K+、Ca2+、作為干擾物質代表。分別取上述離子1 mmol/L加入到100 μmol/L的NO-2溶液中，使用Cu-MOFs/GCE，通過DPV法獲得伏安曲線，以NO-2的氧化峰電流強度為指標，評估Cu-MOFs/GCE的選擇性及抗干擾能力。

為了考察Cu-MOFs/GCE的穩定性，將制備的Cu-MOFs/GCE置于密閉環境中，在25 ℃左右的室溫保存，并使用該電極對100 μmol/L的NO-2進行檢測，連續7 d記錄每天獲得的伏安曲線。

1.3.4 肉制品檢測

購買培根、火腿腸、醬牛肉和豬肉脯共4 種常見肉制品作為待測樣品。首先，使用料理機分別將每種樣品攪碎混勻；其次，準確稱量5 g樣品放入錐形瓶中，加入80 mL水并超聲30 min，超聲過程中每隔3 min搖晃錐形瓶，使固態樣品完全分散；然后，將錐形瓶置于75 ℃的水浴鍋中，水浴加熱5 min，冷卻至室溫后，將樣品轉移至100 mL容量瓶中，并加入純水定容至刻度；接著，將樣品溶液用濾紙過濾，濾液10 000 r/min離心15 min，取上清液備用；最后，將上清液用水系一次性針頭微孔濾膜過濾，使用C18柱純化，獲得樣品提取液。通過建立的電化學方法，使用Cu-MOF為工作電極，測定樣品提取液中亞硝酸鹽含量。

1.4 數據處理

通過Microsoft Excel統計并分析實驗數據，并將數據信息輸入Origin軟件繪制圖片。

2 結果與分析

2.1 修飾電極的形貌表征

電極修飾流程如圖1所示。首先，通過電化學還原電解液中的銅離子生成銅單質，沉積在電極表面，電極表面會形成1 層黃色的銅膜；然后，利用堿性氧化作用，將電極表面的銅轉化為Cu(OH)2，可以看到電極表面由黃色變為藍色；最后，使用交聯劑H3BTC將Cu(OH)2轉化為Cu-MOFs，可以觀察到電極表面由藍色變為藍綠色。電極表面各修飾階段發生的化學反應依次為：

圖1 修飾電極的制備過程及其電極表面圖像Fig. 1 Flow chart for the preparation of the modified electrode and image of the electrode surface at each step

① Cu2++2e→Cu

② Cu+2OH--2e→Cu(OH)2

③ 3Cu(OH)2+2H3BTC→Cu3(BTC)2+6H2O

通過掃描電鏡觀察電極表面修飾的Cu、Cu(OH)2和Cu-MOFs的微觀結構，結果如圖2所示。采用電沉積在電極表面修飾的銅呈顆粒狀；經堿性氧化處理，在銅粒子基底上生成的Cu(OH)2呈納米帶狀，納米帶相互交錯隨機排列；利用交聯劑H3BTC將Cu(OH)2轉化為Cu-MOFs，生成的Cu-MOFs呈八面體結構。上述結果直觀證明了Cu-MOFs在電極表面被成功制備。

圖2 電極表面修飾的Cu（a）、Cu(OH)2（b）、Cu-MOFs（c、d）掃描電鏡圖Fig. 2 SEM images of modified Cu (a), Cu(OH)2 (b), Cu-MOFs (c, d)on the electrode surface

2.2 修飾電極對NO-2的電催化性能分析

采用DPV法收集NO-2在電極表面電化學行為的相關數據，結果如圖3a所示。在空白的電解液中，GCE和Cu-MOFs/GCE獲得的伏安曲線均無明顯的氧化峰。當電解液有NO-2存在，GCE和Cu-MOFs/GCE獲得的伏安曲線均在0.8 V左右處出現一個明顯的氧化峰，其原因為NO-2在工作電極表面發生氧化反應。NO-2在電位作用時，失去電子生成NO2，NO2又發生均相的歧化反應生成NO-3和NO-2。在含有100 μmol/L的NO-2的電解液中，GCE獲得的峰電流為2.02 μA，Cu-MOFs/GCE獲得的峰電流為4.76 μA，Cu-MOFs/GCE獲得的NO-2氧化峰電流是傳統GCE的2.36 倍。以上結果表明，電極表面修飾的Cu-MOFs能夠催化NO-2氧化反應，增強電極的響應信號，有利于提高NO-2檢測的靈敏度。

為了進一步考察NO-2在Cu-MOFs/GCE電極表面的電化學行為，采用CV技術分別設置不同的掃描速率（20、40、60、80、100 mV/s），觀察NO-2氧化峰電流隨掃描速率的變化。從圖4可知，Cu-MOFs/GCE在NO-2的電解質中獲得的峰電流強度隨掃描速率逐漸增加，峰電流強度與CV掃描速率呈良好的線性關系（R2=0.98），說明NO-2在電極表面的電化學氧化反應是表面控制過程[27]。

圖4 不同掃描速率時Cu-MOFs/GCE在含有100 μmol/L NO－2的電解質中的循環伏安曲線（a）及對應的線性擬合曲線（b）Fig. 4 Cyclic voltammograms (a) of Cu-MOFs/GCE in the electrolyte containing 100 μmol/L NO－2 at different scan rates and resulting calibration curve (b)

2.3 Cu-MOFs/GCE的標準曲線和檢測限

為了得到Cu-MOFs/GCE的線性工作范圍數據，通過DPV法獲得不同濃度NO-2的響應信號。圖5a為Cu-MOFs/GCE檢測10、20、30、40、60、80、100、120、140、160、180、200、240、280、320、360、400、500、600、800、1 000、1 200 μmol/L NO-2獲得的伏安曲線，0.8 V處的氧化峰電流強度隨NO-2濃度增大而逐漸增加。以峰電流強度為縱坐標，NO-2濃度為橫坐標，建立如圖5b所示的標準曲線，在濃度10～1 200 μmol/L范圍內，Cu-MOFs/GCE的峰電流強度與NO-2濃度呈良好的線性關系，線性回歸方程為：y=0.033x+1.182，R2=0.99。依據3 倍信噪比計算，Cu-MOFs/GCE對NO-2的檢測限為1.57 μmol/L。與已報道的NO-2電化學傳感器相比[28-30]，Cu-MOFs/GCE具有檢測限低、靈敏度高、線性范圍寬、制備簡單等優勢。

2.4 Cu-MOFs/GCE的選擇性和穩定性

在食品亞硝酸鹽檢測中，NO2-常與其他離子共存，因此需要對Cu-MOFs/GCE的選擇性進行研究。選擇食品中常見的離子包括Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl-、作為干擾物質代表。圖6a結果顯示，在NO-2溶液中添加這些離子，NO-2的氧化峰電流沒有明顯變化（小于5%），說明Cu-MOFs/GCE具有良好的選擇性。

為了考察Cu-MOFs/GCE的穩定性，采用DPV法連續記錄Cu-MOFs/GCE對100 μmol/L NO-2的響應電流。圖6b結果顯示，Cu-MOFs/GCE獲得的電流信號隨使用時間延長有下降趨勢，這可能是因為Cu-MOFs/GCE在貯存過程的電極表面發生鈍化。經統計分析，在連續測量7 d后，Cu-MOFs/GCE的電流信號比初始電流響應值僅降低了10%左右，說明制備的Cu-MOFs/GCE具有較好的穩定性。

2.5 肉制品中亞硝酸鹽的檢測

采用電化學DPV法，以Cu-MOFs/GCE作為工作電極，采集肉制品樣品提取液中亞硝酸鹽的響應信號，并結合多次標準加入法，獲得亞硝酸鹽濃度信息。結合樣品前處理方法，Cu-MOFs/GCE對肉制品中亞硝酸鹽的檢測限為2.17 mg/kg，遠低于GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》規定的最大殘留量30 mg/kg，因此該傳感器能夠滿足國標限量標準的檢測要求。基于樣品提取液中亞硝酸鹽濃度，計算得到肉制品中亞硝酸鹽含量如表1所示，結果表明檢測的肉制品中以NaNO2計的亞硝酸鹽含量均低于GB 2760—2014規定的最大殘留量。為了驗證檢測結果的準確性，同時采用GB 5009.33—2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》規定的第二法（分光光度-鹽酸萘乙二胺法）對樣品中的亞硝酸鹽進行測定，結果顯示這2 種方法獲得的檢測結果基本一致，相對誤差均低于10%。上述試驗結果說明，基于Cu-MOFs/GCE的電化學方法，在肉制品亞硝酸鹽測定中具有較好的準確性。

表1 肉制品中亞硝酸鹽檢測結果Table 1 Results of nitrite determination in different meat products

3 結 論

通過電化學法在電極表面原位合成Cu-MOFs，制備了用于肉制品中亞硝酸鹽檢測的電化學傳感器。電極表面修飾的Cu-MOFs對電化學氧化NO-2反應具有催化作用，能夠增強電極對NO-2的響應信號。以Cu-MOFs/GCE為工作電極，通過DPV法對NO-2進行測定，線性工作范圍為10～1 200 μmol/L，檢測限為1.57 μmol/L，且該修飾電極具有良好的選擇性和穩定性。使用Cu-MOFs/GCE檢測肉制品中亞硝酸鹽，結果顯示該電極獲得的檢測結果與鹽酸萘乙二胺法的結果基本一致，相對誤差低于10%，證明該修飾電極可以用于肉制品中亞硝酸鹽的檢測。本實驗構建了基于Cu-MOFs的電化學傳感器，建立了肉制品中亞硝酸鹽的快速檢測方法，為食品亞硝酸鹽檢測提供了新思路。