牛肉、牛奶中可的松和氫化可的松含量分析

楊 奕，尹 杰，楊蘊嘉，張 晶

（北京市疾病預防控制中心，北京市預防醫學研究中心，北京 100013）

激素類物質是調節機體正常生長、發育、生殖等重要生命活動的關鍵生物活性成分。根據化學結構的不同，激素可分為肽類、氨基酸類、胺類和類固醇類。類固醇類激素又包括腎上腺皮質激素（皮質醇、醛固酮等）和性激素（雌激素、孕激素及雄激素等）。在動物食品安全領域，激素類藥物的殘留是消費者最為關注的議題；另一方面，動物組織中會天然存在一些自身細胞合成和分泌、調節生理活動的內源性激素物質，如同屬于糖皮質激素的氫化可的松和可的松[1-3]。GB 31650—2019《食品中獸藥最大殘留限量》規定可的松可以在馬、牛、豬、羊4 種動物的飼養過程中使用，氫化可的松可以在所有動物飼養中使用但僅限于外用，并且可的松和氫化可的松均不需要制定最大殘留限量[4]。然而，歐盟和加拿大規定牛奶和羊奶中氫化可的松的殘留限量為10 μg/kg[5-6]。在我國的進出口食品國際貿易中，食品中農獸藥法規限量的差異可能導致食品退運等問題，給我國食品出口企業帶來了沉重的經濟負擔[7-9]。有研究表明，盡管皮質醇激素在生物體的正常生理活動中起到重要的調節作用，但是長期大劑量地使用皮質醇激素會導致骨質疏松、高血壓、肥胖、急性心肌梗死、感染等不良反應[10-12]。因此，開展可的松和氫化可的松在主要食品中的含量水平研究，獲得這2 種化合物在牛奶等動物性食品中的存在水平，不僅對于保護消費者健康具有重要意義，同時也對我國農產品國際貿易具有重要的價值[13-15]。

現有國內外文獻中，有關激素類藥物的檢測技術報道較多[16-27]，部分文獻也涉及到可的松和氫化可的松，但是這些研究多集中于分析方法本身，樣本監測相對較少。Ma Lili等[28]檢測發現牛奶中氫化可的松的含量水平在2 μg/kg以下；Chiesa等[29]分析了原料乳樣品中多種激素的含量，得到可的松和氫化可的松的平均值分別為1.06 μg/L和2.56 μg/L。但是，以上研究均存在樣本量少等問題，不足以獲得動物體內內源性激素含量水平的閾值[30]。此外，由于不同產地牛在養殖過程中投喂的飼料不同，且飼養習慣也有所差異，可能會導致牛肉和牛奶中可的松和氫化可的松含量不同。因此，本研究擬通過大量樣本采集，分析市售牛肉和牛奶中可的松和氫化可的松的含量水平，初步獲得兩類產品中可的松和氫化可的松的含量范圍，對不同產地的牛肉和牛奶中可的松和氫化可的松含量進行分析，旨在為動物性食品的安全保障提供技術支持及數據基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

可的松、氫化可的松、同位素內標氫化可的松-D3德國Dr. Ehrenstoffer公司；甲酸、乙酸、乙酸鈉（均為分析純） 美國百靈威公司；甲醇、乙腈（均為色譜級）美國Fisher公司；β-葡糖醛酸苷肽酶/芳基磺酸酯酶溶液美國羅氏公司；其他試劑均為國產分析純；石墨化碳黑固相萃取柱（ENVI-CarbTM） 安譜集團有限公司；氨基固相萃取柱、Acquity UPLC超高效液相色譜儀、Xevo TQ-S三重四極桿串聯質譜儀 美國Waters公司；實驗用水為Milli-Q超純水。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法

試樣中的目標化合物檢測采用GB/T 21891—2008《動物源性食品中的激素多殘留檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法》，主要步驟如下：稱取樣品5 g（精確至0.01 g）置于50 mL離心管中。準確加入100 μg/L氫化可的松-D3溶液100 μL和10 mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，混勻后再加入100 μL葡萄糖酸苷肽酶/磺酸酯酶溶液于37 ℃水浴搖床中酶解過夜，取出后再加入25 mL甲醇，超聲提取30 min。提取液ENVI-Carb固相萃取柱和氨基柱凈化，洗脫液并在微弱的氮氣流下吹干，用1 mL甲醇-水（50∶50，V/V）溶解殘渣上機測定。液相色譜串聯質譜儀器方法參數均參考GB/T 21891—2008。

1.2.2 方法學驗證

配制系列混合標準溶液，質量濃度分別為0、0.5、1、2.5、5、10、20、50 μg/L和100 μg/L，均含有氫化可的松-D3同位素內標各10 μg/L。經液相色譜-串聯質譜測定，以目標化合物的定量離子峰面積與內標峰面積之比為縱坐標，待測組分的質量濃度為橫坐標，繪制內標工作曲線。

在均質的空白樣品中加入適量混合標準溶液，使樣品中可的松、氫化可的松的加標量分別為0.1、1 μg/kg和5 μg/kg，內標氫化可的松-D3均為2 μg/kg。每個水平設6 個平行，計算目標化合物的回收率和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.2.3 樣品收集

采用方便抽樣的方法，在我國不同區域的城市超市、農貿市場等地采集市售牛肉、牛奶樣品。所有樣品采集后立即運往實驗室，-20 ℃冷凍保存。

1.3 數據統計

應用SPSS 21.0軟件進行數據統計分析，統計分析前所有計量資料經正態性檢驗判斷是否符合正態分布。對于符合正態分布的數據，以描述；不符合正態分布的數據，用最大值、平均值、中位數和95百分數（P95）進行統計描述。采用Spearman秩相關性分析法對樣品中可的松和氫化可的松含量相關性進行分析。P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 方法學驗證結果

對檢測方法開展實驗室內方法確證。結果表明，可的松和氫化可的松均在0.5～100 μg/L內呈良好的線性，相關系數r2大于0.999 3。2 種目標化合物的檢出限均為0.04 μg/kg，定量限均為0.1 μg/kg（表1）。3 個加標水平下，可的松和氫化可的松的回收率在83.6%～113.5%之間，RSD為2.4%～10.5%，表明該方法具有良好的線性、準確度和精密度。

表1 可的松和氫化可的松的線性范圍、檢出限和定量限Table 1 Calibration equation, LOD and LOQ for corstione and cortisol

2.2 樣品收集

本研究從浙江、湖南、山東、黑龍江、云南、陜西、四川、北京、寧夏等省、市、自治區的超市、農貿市場采集牛肉樣品188 件和牛奶樣品158 件，共計346 件樣品。如圖1所示，采樣地點涵蓋了我國東北、華北、華東、西北、西南以及華中地區6大地理區域，具有一定代表性。此外，對本研究采集的346 件樣品的產地進行分析，牛肉和牛奶的產地除了采集地以外，還涉及河北、安徽等地。

圖1 牛肉和牛奶樣品采集地和產地分布圖Fig. 1 Regional distribution of of beef and milk samples collected in this study

2.3 可的松和氫化可的松含量水平分析

采用液相色譜-串聯質譜法檢測346 件牛肉和牛奶樣本中可的松和氫化可的松的含量，將所有檢測結果小于檢出限視為未檢出，發現牛肉和牛奶中可的松的檢出率分別為88.8%和86.1%，氫化可的松的檢出率分別為99.5%和100%。參照世界衛生組織有關膳食中污染物含量的統計方法[31]，在數據分析中對測定結果小于定量限的樣本按照0.5 倍定量限（0.05 μg/kg）進行賦值，對測定結果小于檢出限的樣本按照0.5 倍檢出限（0.02 μg/kg）進行賦值。

利用Shapiro-Wilk檢驗（W檢驗）方法對賦值后的牛肉和牛奶中可的松和氫化可的松的含量進行正態性檢驗，結果如表2所示。牛肉中可的松和氫化可的松，以及牛奶中可的松含量正態性檢驗的P值均小于0.05，呈非正態分布；而牛奶中氫化可的松含量的正態性檢驗的P值大于0.05，呈正態分布。因此，本研究對牛肉中可的松和氫化可的松，以及牛奶中可的松含量的統計描述采用最大值、平均值、中位數和P95；對牛奶中氫化可的松含量的統計描述除采用上述指標外，還計算了標準差。

表2 牛肉和牛奶中可的松、氫化可的松含量的Shapiro-Wilk檢驗結果Table 2 Results of Shapiro-Wilk test of cortisone and cortisol contents in beef and milk

如表3所示，在188 件牛肉樣品中可的松含量的最大值為12.71 μg/kg，最小值為0.02 μg/kg，其平均值和中位值分別為1.69 μg/kg和1.14 μg/kg，P95為5.15 μg/kg。牛肉中氫化可的松含量在0.02～74.88 μg/kg之間，其平均值和中位值分別為12.16 μg/kg和8.14 μg/kg，P95為34.18 μg/kg。牛奶中可的松最高含量為1.80 μg/kg，最低含量為0.02 μg/kg，其平均值和中位值均為0.23 μg/kg，P95為0.40 μg/kg。然而，對于牛奶中的氫化可的松而言，由于其濃度值符合正態分布，因此用均值和標準偏差對其進行統計描述。結果表明，牛奶中氫化可的松含量為（0.72±0.35） μg/kg，P95為1.31 μg/kg。

表3 牛肉和牛奶中可的松和氫化可的松的含量水平Table 3 Cortiaone and cortisol contents in beef and milk samples μg/kg

由于激素是生物體內天然存在的物質，具有多種生理功能與生長發育密切相關，因此肉和奶等動物性食品中通常會含有一定量的皮質醇激素等內源性激素[21-25]。Ma Lili等[28]利用液相色譜-串聯質譜方法檢測牛奶中12 種皮質醇激素，在10 份牛奶樣本中只檢測到了氫化可的松，其含量為0.69～1.82 μg/kg。在另一項研究中，Chiesa等[29]分析了50 份牛奶樣品種多種激素的含量，得到可的松和氫化可的松在牛奶中含量的平均值分別為1.06 μg/L和2.56 μg/L。Goyon等[32]監測了來自荷蘭3 家農場的多份牛奶樣品，發現產自荷蘭的牛奶中可的松和氫化可的松含量平均值分別為112 ng/kg和235 ng/kg。在本課題組前期的研究中，測定了牛肉、雞肉等可食用肌肉組織中可的松和氫化可的松含量為0.3～14.7 μg/kg[19]。通過比較發現，本研究測得的牛肉和牛奶中可的松、氫化可的松的含量水平與文獻報道的結果相當。

2.4 不同產地牛肉和牛奶中可的松、氫化可的松含量水平

本研究對不同產地的牛肉和牛奶中可的松、氫化可的松的含量水平進行了比較。188 份牛肉樣品的產地來自于安徽、北京、河北、黑龍江、湖南、內蒙古、寧夏、山東、陜西、上海、四川、云南和浙江13 個省市自治區，其中安徽、北京、上海、河北、陜西和浙江6 產地的樣本量均小于10，不再納入統計分析。同樣的，158 份牛奶樣品也來自安徽、北京、廣東等12 個省市自治區，其中安徽、廣東、江蘇、河北、內蒙古、寧夏以及天津產地的樣本量均小于10，不再納入統計分析。從圖2可以看出，不同產地牛肉樣品中可的松含量的平均值在0.29～3.44 μg/kg之間，中位數在0.02～2.87 μg/kg之間，氫化可的松含量平均值在5.94～0.33 μg/kg之間，中位數為5.58～16.68 μg/kg。不同產地牛奶中可的松含量平均值在0.13～0.32 μg/kg之間，中位數為0.15～0.31 μg/kg；氫化可的松含量平均值在0.43～1.07 μg/kg之間，中位數為0.46～1.06 μg/kg。從圖2可以看出，不同產地的牛肉、牛奶中可的松和氫化可的松的含量水平存在一定差異，提示地理環境因素可能會對肉牛和乳牛的激素分泌產生影響。但是由于本研究不同產地的樣本數量不完全一致，且未考慮品種、牛齡、采樣時間等因素的影響，因此目標化合物濃度水平與樣品產地的關系需要進一步研究。

圖2 不同產地牛肉和牛奶中可的松、氫化可的松的含量分布Fig. 2 Distribution of cortisone and cortisol in beef and milk from different regions

2.5 可的松和氫化可的松含量相關性分析

利用相關性檢驗考察樣品中2 種目標化合物含量的相關性，計算2 種化合物含量的比值。分析結果顯示，牛肉和牛奶中可的松和氫化可的松的含量均呈顯著正相關（圖3），相關系數分別為0.735（P＜0.001）和0.809（P＜0.001）。牛肉中氫化可的松與可的松的含量比值范圍為1.0～44.5，平均值為8.58，中位數為7.05。牛奶中氫化可的松與可的松含量比值的范圍為1.1～25.4，平均值為4.33，中位數為3.40。上述結果表明，2 種內源性激素在肉牛和乳牛體內可能具有相同的合成、分泌和代謝途徑。

圖3 牛肉（A）和牛奶（B）中可的松和氫化可的松相關性Fig. 3 Correlations between cortisone and cortisol contents in beef (A) and milk (B)

3 結 論

本研究采用液相色譜-串聯質譜檢測方法分析采自我國9 個省、市、自治區的346 份牛肉和牛奶樣品中可的松和氫化可的松的含量水平。在牛肉和牛奶樣品中可的松和氫化可的松普遍檢出，檢出率均超過80%，可的松和氫化可的松的含量水平均小于100 μg/kg，且存在一定的地域差異。牛肉中可的松和氫化可的松，以及牛奶中可的松含量呈非正態分布，中位值分別為1.14、8.14 μg/kg和0.23 μg/kg。牛奶中的氫化可的松含量呈正態分布，其含量平均值為（0.72±0.35） μg/kg。以含量的P95評估牛肉可的松和氫化可的松含量范圍分別為小于5.15 μg/kg和34.18 μg/kg，牛奶可的松和氫化可的松含量范圍分別為小于0.40 μg/kg和1.31 μg/kg。此外，相關性檢驗分析結果表明牛肉和牛奶2 類樣品中可的松和氫化可的松的含量均呈顯著正相關，為食品中激素殘留的科學監管提供了新思路。