氣相色譜-質譜聯機結合感官分析共建櫻桃香氣關聯網絡

邱 爽，唐 飛，劉 暢，謝美林，魏陽吉,*，李景明,*

（1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2.中化現代農業有限公司，北京 100031）

風味是食品的重要特征，由香、味、感組成，其中香氣最為重要。食品香氣是指食品各種風味物質中一小部分具有致香活性的物質[1]，尤其在水果中，盡管香氣僅占水果鮮質量的0.01%～0.001%，但它們是構成和影響水果鮮食及加工品品質的重要因素，也是吸引消費者和鞏固市場的關鍵[2-3]。

香氣物質的分析方法包括感官分析與儀器分析。感官分析可以從視覺、嗅覺、味覺進行分析，作出綜合評價，具有簡單、直接、可描述的特點[4-5]，但也具有成本高、主觀性強、重現性差、不適于分析大量樣本的缺點[6-7]。香氣研究的儀器分析法中氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法因靈敏度高、可重復，是香氣研究的主要手段。但是GC-MS作為一種間接的分析手段無法得知某種香氣物質對整體香氣的貢獻大小，且其結果不能可視化，具有不可感知的缺點[8]。因此在食品香氣研究中，如何將感官分析與儀器分析協調融合，是香氣研究領域的熱點問題。氣相色譜-嗅聞（gas chromatography-olfactometry，GC-O）從儀器研發角度探索現代儀器分析與感官相結合的方法，并成功發現了一些含量微弱但感知閾值很低的香氣成分，還檢測到了一些難揮發性香氣物質[9]，電子鼻將傳感器引入香氣成分分析，對采集到的氣敏型信號進行數學分析，以求模擬人類對氣味的認知。隨后有大量研究針對香氣成分GC-MS聯機鑒定結果進行數學分析，以求實現模式判別[10-12]。如Petronilho等[13]對葡萄酒的揮發性成分進行了全面測定，利用不同提取技術和GC分析相結合建立了由2 個不同節點組成的基于二部網絡的方法，一個節點包含19 個香氣描述符，另一個節點包含相應的揮發性化合物。但電子鼻及GC-MS聯機結果的數學分析等研究成果，大都具有脫離實際食品香氣感官特征的缺陷。如何將真實的食品感官特征性感受與GC-MS聯機結果銜接，確定二者關聯性，以GC-MS聯機分析替代或部分替代感官品評，是非常值得探討的方向。

櫻桃屬薔薇科，李屬類植物，在世界各地廣泛種植[14]，有“早春第一果”的佳譽。櫻桃具有極高的營養價值[15-16]，更以香氣濃郁著稱，其香氣特性在國內外受到普遍關注和研究報道[17-19]。櫻桃中的風味物質主要有醛類、醇類、酮類、酸類、酯類以及萜烯類化合物[3,20]。Mattheis等[21]采用動態頂空法從‘Bing’甜櫻桃中檢測出28 種香氣成分，主要為2-丙醇、苯甲醛、己醛。Girard[19]、Bernalte[22]等對一些歐美櫻桃品種的香氣成分進行了研究，除上述特征香氣外，發現(E)-2-己烯醛、(E)-2-己烯-1-醇也是甜櫻桃果實中最重要的香氣成分。Petersen等[23]采用溶劑萃取法對酸櫻桃的香氣成分進行了研究，將香蘭素和丁子香酚補充到櫻桃重要香氣成分中。Wen Yaqin[17]、Sun Shuyang[24]等對不同櫻桃品種的香氣成分進行了測定，結果表明不同櫻桃品種的香氣特征相似，但這些香氣化合物對每種櫻桃的貢獻存在顯著差異。所以只有明確櫻桃產品的香氣特征才能更好地完善產品風味與質量。本實驗在此背景下，以香氣感官特征鮮明的水果櫻桃為實驗材料，采用頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase microextraction，HS-SPME）聯合GC-MS技術對櫻桃香氣成分進行測定，并進行香氣感官品評，利用Pearson分析建立香氣感官品評與GC-MS結果間的關聯網絡，旨在為食品香氣研究中GC-MS分析替代感官品評提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

9 個不同品種櫻桃（品種信息見表1）由山東省煙臺市福山區煙臺錦程大櫻桃種植基地（37°26’38”N，121°16’0.3”E）提供，該地區屬低山丘陵區，土壤以棕壤土為主，土層深厚、疏松、保水保肥力強，氣候屬溫暖半濕潤易旱區，氣候溫和、四季分明，適合櫻桃的生長。櫻桃采收時間為2019年5月下旬，采樣方式為隨機取樣法，隨機選擇6 個生長一致的櫻桃植株作為樣株，按照商業成熟標準，從樣株的外圍隨機采果5 kg，采后用保鮮盒盛裝，用帶有冰袋的保溫箱24 h內運輸至實驗室。樣品到達實驗室后，24 h內及時開展感官品評，同時從中挑選1 kg健康、成熟度一致、大小一致的果實，液氮快速冷凍后，于-40 ℃貯存待分析。

表1 櫻桃樣品信息匯總Table 1 Information about cherry samples tested in this study

正構烷烴C7～C40、乙醇、甲醇（均為色譜純）上海安普實驗科技有限公司；碳酸鈉、氯化鈉、無水乙醇、交聯聚乙烯吡咯烷酮、D-葡萄糖酸內酯 北京百靈威科技有限公司；2-壬酮（色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

GL-20G-II型高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；BSA124S-CW分析天平 德國塞利多斯公司；RZ-708H干磨料理機 榮事達公司；7890B型色譜儀、5977B型質譜、HP-5MS毛細管色譜柱（30 mm×0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司；二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取頭 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 HS-SPME-GC-MS分析

1.3.1.1 樣品制備

參照Chen Kai等[25]的方法。從-40 ℃的冰箱中取櫻桃若干，液氮環境下去核初破碎，稱取約30 g櫻桃，加入0.60 g交聯聚乙烯吡咯烷酮，0.30 gD-葡萄糖酸內酯，破碎機破碎成粉末狀，隨后迅速轉移至50 mL離心管中置于4 ℃冰箱保存4 h。4 h后取出樣品，4 ℃、8 000 r/min離心15 min，取上清液備用。

1.3.1.2 HS-SPME

取5 mL澄清櫻桃汁，加入10 μL 2-壬酮（8.22 mg/L）作為內標物、1 g NaCl和磁力轉子置于20 mL頂空瓶中，加蓋密封后置于磁力攪拌臺上，40 ℃平衡30 min，待氣液兩相達到平衡后，將老化后的長度為2 cm、厚度為50/30 μm的DVB/CAR/PDMS萃取頭插入頂空瓶置于液面上方1 cm處，40 ℃吸附30 min，然后將SPME萃取頭拔出插入GC-MS進樣口，250 ℃熱解吸8 min。

1.3.1.3 GC-MS分析

參考Wen Yaqin等[17]的方法，并稍作修改。

GC-MS條件：HP-5MS毛細管色譜柱（30 mm×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣（He＞99.999%），流速1 mL/min。固相微萃取手動進樣，不分流進樣，進樣口溫度250 ℃，熱解吸時間8 min。升溫程序：40 ℃保持3 min，然后以5 ℃/min升溫到85 ℃，保持2 min，然后以2 ℃/min升溫到130 ℃，保持2 min，再以6 ℃/min升溫到210 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升溫到250 ℃，保持2 min。電子電離源；離子能量70 eV；質量掃描范圍40～450 u。

1.3.1.4 揮發性成分的定性、定量分析

GC-MS實驗數據由NIST17數據庫的相似度檢索進行初步定性，同時結合參考文獻中相應化合物的保留指數進一步定性。

將正構烷烴（C7～C40）標準品在相同GC-MS條件下直接液體上樣分析，計算保留指數，通過與NIST17數據庫參考文獻中相應物質的保留指數對比，進一步對樣品中的香氣物質進行定性。保留指數按式（1）計算：

式中：tx、tn、t（n+1）分別為待測物x、具有n、（n+1）個碳原子正構烷烴的保留時間/min。

利用內標法（2-壬酮）對香氣物質進行定量，按式（2）計算：

式中：Cx和Mx分別為待測香氣物質的質量濃度/（mg/L）和峰面積；Cy和My分別為內標物的質量濃度/（mg/L）和峰面積。

1.3.2 香氣感官品評

1.3.2.1 感官評價人員的篩選

通過發放電子調查問卷的形式對報名人員的基本信息、健康狀況等方面進行調查，進行初步篩選。經過GB/T 16291.1—2012《感官分析 選拔、培訓與管理評價員一般導則 第1部分：優選評價員》中味覺測驗、GB/T 12312—2012《感官分析 味覺敏感度的測定方法》中味覺靈敏度測驗、GB/T 15549—1995《感官分析 方法學 檢測和識別氣味方面評價員的入門和培訓》中香氣識別能力測驗后，進一步篩選出櫻桃感官評價小組成員27 人，后備5 人，年齡跨度19～35 歲，男女比例1∶2。

1.3.2.2 櫻桃品評

本項目的品嘗工作均在符合以下規定的品評室內進行：光照適宜、亮度一致，便于清掃且無噪音，無任何氣味，便于通氣或排氣，溫度恒定（23～25 ℃）。收到新鮮櫻桃樣品后24 h之內開展香氣感官品評實驗，以部分櫻桃樣品為試品讓品評員建立櫻桃香氣描述詞。為避免已知品種名稱對品評效果的影響，將9 種櫻桃樣品分為3 組，分別以三位密碼編號按順序呈送，評價員按順序聞香、品嘗，每次品嘗后，用清水漱口。品評員根據櫻桃香氣描述詞對9 個品種櫻桃所感知到的香氣進行選擇，統計每種櫻桃中香氣描述詞出現的頻率，繪制風味雷達圖。

1.3.3 基于Pearson相關系數建立櫻桃香氣感官品評與GC-MS結果間的關聯網絡

Pearson相關系數法常用于分析2 個變量X和Y之間的關系密切程度，可以評估2 個連續變量之間的線性關系。對于變量X=[x1，x2，…，xn]T和Y=[y1，y2，…，yn]T，其相關系數r的取值為[-1，1]，接近0代表無相關性，接近1或-1代表強相關性。按式（3）[26]計算：

理論上，Pearson與Spearman相關系數分別僅用于評估線性關系與單調關系。因此，后者對于數據錯誤和極端值的反映沒有前者敏感。為了使兩套數據更符合線性回歸的規律，剔除可能會影響分析結果的錯誤數據和極端值，本研究選擇Pearson相關系數對櫻桃香氣感官品評結果與GC-MS分析得到的香氣物質含量數據之間進行Pearson分析，以建立二者之間的關聯網絡。

1.4 數據統計

采用SPSS 24.0進行數據的統計學分析；相關性分析，熱圖由R（Rx64 3.6.3）軟件分析繪制；關聯網絡由Gephi軟件分析繪制；偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）分析由The Unscrambler X 10.4軟件分析。

2 結果與分析

2.1 GC-MS分析結果

通過GC-MS對9 個不同品種櫻桃中香氣物質進行定性、定量分析，共鑒定出63 種香氣成分，大多數化合物在文獻中均有報道[17-18]。其中酯類17 種，醇類10 種，醛類15 種，萜烯類10 種，酮類7 種，酸類種類較少，僅有1 種。此外，還有3 種其他化合物被檢出。不同品種櫻桃中香氣物質總離子流圖見圖1，香氣物質的平均質量濃度見表2。

表2 櫻桃果實香氣物質質量濃度Table 2 Concentrations of aroma compounds in cherry fruit

續表2

圖1 各櫻桃品種香氣總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatograms of aroma substances in different cherry varieties

醛類物質是櫻桃香氣中最主要的組分，這在前期研究中已經得到了證實[17,24]。除美早櫻桃外，醛類化合物在所有櫻桃樣品香氣中的比例均高于70%，以意大利紅櫻桃中醛類香氣物質含量最高，達到42 635.3 μg/L。C6醛類和芳香醛類，如己醛、(E)-2-己烯醛、苯甲醛是櫻桃的主要香氣物質，這與相關報道一致[19,24]。己醛在薩米脫櫻桃中質量濃度最高，為15 550.73 μg/L，占醛類物質整體的53.14%，具有較強的青香和蔬菜味。紅燈、黑珍珠和雷尼櫻桃中(E)-2-己烯醛占比較高，占醛類物質整體的50%以上，賦予櫻桃蘋果和生青味。意大利紅和水晶櫻桃含有較高的苯甲醛，它們來源于核果中苦杏仁苷的酶促水解或衍生自苯丙氨酸和苯甲醇等前體，具有強烈的烘烤味、扁桃仁味[19]。此外，壬醛、癸醛也是所有櫻桃共有的醛類香氣，賦予櫻桃生青和柑橘味[17]。果實中醛類物質的形成和脂肪酸代謝途徑有關，脂肪酸氧化途徑可產生直鏈脂肪族醇、酯、醛和酮。在脂氧合酶的催化下，不飽和脂肪酸會生成C9、C10或C13氫過氧化物。這些物質可以在脂氫過氧化物裂解酶的作用下斷裂，然后生成C6、C9或C10醛，而青草香和果香是以脂肪酸為前體的代謝產物的主要香氣特征[27]。

除醛類香氣外，萜烯類、醇類和酮類香氣是櫻桃果實中質量濃度較高的組分。主要的萜烯類香氣包括里那醇、香葉醇、橙花醇、β-大馬士酮，其中里那醇、香葉醇均具有較強的柑橘味。酮類香氣物質主要包括香葉基丙酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮，二者在其他櫻桃品種中也有過報道[19,24]。其中，6-甲基-5-庚烯-2-酮和β-大馬士酮為櫻桃中主要的降異戊二烯類香氣，這些物質可能來自類胡蘿卜素分子的直接降解，如β-胡蘿卜素、葉黃素以及紫黃素等。降異戊二烯類香氣物質的含量并不高，但因為它們的感官閾值比較低，特別是在酒中的作用不容忽視，可為葡萄酒帶來豐富的花香、果香[28]。相比之下，酯類、酸類和其他類香氣的質量濃度相對較低。除美早和佐藤堇櫻桃外，其余7 種櫻桃酯類、酸類以及其他類香氣僅占香氣總量的0.3%～2%。美早和佐藤堇含有相對較高的酯類香氣，尤其是4-己烯-1-醇乙酸酯與苯甲酸乙酯，這也是二者特有的酯類香氣。值得注意的是，美早櫻桃中酯類香氣在種類和質量濃度上均較高，因而可能含有更強的果香和酒香。

2.2 香氣感官品評結果

如圖2所示，有60%以上的品評員在9 個品種櫻桃中均聞到了明顯的青草味，蘋果味也能被20%以上的品評員所感知。盡管青草和蘋果香氣是所有櫻桃品種中共有的特征香氣，但不同品種櫻桃香氣間仍存在較大差異。如紅燈、意大利紅和雷尼櫻桃具有一定的甜橙味，紅燈、美早櫻桃分別具有獨特的檸檬味和酒味，杏仁味在紅燈和薩米脫櫻桃中易被感知，意大利紅、水晶和佐藤堇櫻桃具有一定的李子味。此外，藍莓味和玫瑰味在大多數品種櫻桃中均能夠被感知。

圖2 櫻桃香氣風味剖面圖Fig. 2 Cherry aroma profile

2.3 香氣感官屬性之間的Pearson相關性分析結果

從圖3可看出，甜橙味與玫瑰味（r=0.84，P＜0.01）極顯著正相關，與檸檬味（r=0.70，P＜0.05）顯著正相關，說明樣品的甜橙味對玫瑰味與檸檬味具有不同程度的影響；與上述相似的是，杏仁味與檸檬味（r=0.93，P＜0.01）、玫瑰味（r=0.72，P＜0.05）之間也存在同樣關系。此外，檸檬味與玫瑰味（r=0.76，P＜0.05）達到顯著正相關，表明櫻桃的甜橙味、玫瑰味、檸檬味、杏仁味4 種香氣感官屬性之間相互關聯，它們在櫻桃香氣感官屬性中具有一定的連帶性。此外，蘋果味與藍莓味（r=0.89，P＜0.01）間也達到了極顯著正相關。

圖3 香氣感官屬性之間相關系數散點圖Fig. 3 Scatter diagram showing correlation coefficients between sensory aroma attributes

2.4 關聯網絡結果

對GC-MS分析結果中香氣物質相對質量濃度數據和香氣感官品評結果進行Pearson線性相關分析，繪制相關性熱圖并建立櫻桃香氣關聯網絡，結果分別見圖4、5。

由圖4、5可以發現，共有40 種香氣物質與香氣感官屬性顯著相關（P＜0.05）。香氣感官品評結果表明青草味為櫻桃主要的香氣感官屬性，而相關性分析結果中只有辛醛（新鮮青草味[32]）與青草味呈顯著相關，分析原因可能是萃取頭的選擇性吸附問題。與PDMS萃取頭相比，本研究選擇的三相萃取頭對非極性化合物（醛和酯）的萃取率低，這就導致一些青香香氣（多為醛類化合物）不能被充分吸附，使儀器分析結果中醛類化合物與香氣感官品評結果中的青草味未呈現很好的相關性[24]。

圖4 香氣感官屬性與GC-MS分析結果之間的相關性熱圖Fig. 4 Correlation heat map between sensory aroma attributes and GC-MS analysis results

圖5 關聯網絡圖Fig. 5 Aroma network diagram

整體上看，果香與酯類、醛類香氣物質正相關性較強，Voon等[33]在榴蓮樣品中同樣發現果香與一些酯和醛類香氣有很好的相關性。與甜橙、檸檬味顯著相關的香氣物質多為酯類和萜烯類化合物，多數酯類香氣都具有果香和甜香[33]，萜烯類香氣如里那醇、香葉醇也具有顯著的柑橘味，表明香氣感官結果得到的甜橙味和檸檬味可以很好被GC-MS分析結果解釋；類似的，具有一定果香香氣的苯甲酸甲酯、(E)-2-己烯醛、香葉基丙酮均與杏仁味呈極顯著正相關。

與玫瑰味顯著相關的香氣物質有苯甲酸甲酯、苯甲酸2-乙基己酯和(E)-2-己烯醛，其中苯甲酸甲酯具有較強的花香[34]。

從圖5可以明顯看出，酒味與多種香氣物質呈現相關關系，多為醛類和酯類香氣。前期櫻桃香氣研究報道中均發現櫻桃具有一定的酒香[11,15]，而本研究只有少數品評員感受到了櫻桃的酒香。研究表明一般醇類化合物的感官閾值較高，這可能解釋了本研究中的醇類化合物與感知到的酒味沒有很好相關性的原因。而少數品評員聞到的酒味很可能是由于一些帶有尖銳或辛香、刺激性氣味的化合物存在，如4-乙烯基愈創木酚，或帶有未成熟梅子香的甲酸己酯以及帶有白蘭地酒等酒香的化合物，如己酸乙酯、乙酸異戊酯、壬酸乙酯[11,15,35]，因為這些化合物與酒味高度相關。

從圖5還可以發現，與甜橙味、檸檬味、杏仁味、玫瑰味相關的香氣物質相似，與藍莓味、蘋果味相關的香氣物質相似，這與2.3節中櫻桃的藍莓味與蘋果味顯著相關，甜橙味、檸檬味、杏仁味、玫瑰味4 種感官屬性之間具有較強相關性的研究結果一致。

以上結果均表明櫻桃香氣感官屬性可以很好地被GC-MS分析結果解釋，通過Pearson線性相關分析建立櫻桃香氣感官屬性與GC-MS間的關聯網絡具有一定可行性，證實了GC-MS在香氣研究中具有一定替代感官品評的潛力。

2.5 PLSR分析結果

利用PLSR進一步驗證由Pearson相關分析結果建立香氣感官屬性與GC-MS結果間關聯網絡的可靠性。以經過Pearson相關性分析篩選得到的40 種香氣物質為X軸，9 種感官屬性為Y軸進行分析，如圖6所示，PLSR解釋了71%的X方差和58%的Y方差。位于2 個橢圓之間的香氣感官描述符和香氣物質可以很好被PLSR模型解釋，玫瑰味、甜橙味、杏仁味、檸檬味均與具有一定花香和果香的苯甲酸甲酯、香葉基丙酮、2-(苯甲亞基)辛醇等物質呈現出一定相關性，酒味與(E)-2-辛烯醛、4-乙烯基愈創木酚等多種香氣物質呈正相關，表明這幾種感官屬性可以很好地被GC-MS分析結果解釋。而青草味、李子味、藍莓味、蘋果味4 個感官屬性位于內橢圓，說明這些屬性間的相似度較大，對PLSR模型總方差貢獻不顯著，不能很好地被GC-MS結果解釋[36]。綜合關聯網絡結果，與青草味、李子味、藍莓味、蘋果味相關的香氣物質較少，而其余香氣感官屬性均可以很好地被GC-MS結果中的香氣物質解釋，證實了利用Pearson相關性分析結果建立香氣感官屬性與GC-MS間關聯網絡的可行性。

圖6 香氣感官屬性與GC-MS結果的PLSR分析Fig. 6 PLSR analysis of correlation between sensory aroma attributes and GC-MS results

3 結 論

本研究將櫻桃香氣成分的GC-MS儀器分析數據和香氣感官品評結果相結合，采用Pearson相關性分析對二者的相關性進行分析，建立香氣感官品評與GC-MS儀器分析間的關聯網絡。并利用PLSR分析驗證關聯網絡的準確性。結果表明，香氣感官品評中的甜橙味與里那醇、香葉醇等具有果香和甜橙香氣的化合物達到顯著或極顯著相關；杏仁味、檸檬味同樣與多種具有果香的香氣物質顯著相關；具有強烈花香的苯甲酸甲酯與玫瑰味顯著相關，酒味與多種香氣物質均達到了顯著相關。因此，櫻桃香氣感官品評中獲得的甜橙味、杏仁味、玫瑰味、檸檬味以及酒味等香氣感官屬性都可以被GC-MS分析結果中香氣物質解釋，且通過Pearson相關性分析結果建立香氣感官屬性與GC-MS間關聯網絡可以很好地展示二者之間的關系。

本實驗利用櫻桃香氣研究證明，GC-MS對水果香氣的儀器分析結果與感官品評結果在一定屬性（剖面屬性）上具有一致性，因此，采用Pearson相關性分析，建立香氣感官屬性與GC-MS結果間的關聯網絡，有望將客觀、易于標準化的儀器分析與可視化、可傳遞感知信息的感官品評結合，使儀器分析在水果香氣研究方面具有部分替代感官品評的潛力。