生物合成天然2-苯乙醇細菌的篩選及合成途徑分析

榮紹豐，伍 進，管世敏，蔡寶國，張 碩，李茜茜

（上海應用技術大學香料香精技術與工程學院，上海 201418）

2-苯乙醇因具有令人愉悅的香甜味，不僅可以作為食品添加劑對發酵食品中的其他風味物質起到協調及增效的作用[1]，而且在藥品、化妝品等領域的應用也十分廣泛。目前, 2-苯乙醇主要通過化學合成法制備，但此法原料具有致癌風險，而且產物中常含有一些難以去除的副產物，嚴重影響了產品質量，極大限制了產品的使用范圍[2]。物理提取法可從植物中提取天然2-苯乙醇，但由于植物資源有限、提取效率低等原因不能滿足市場的大規模需求[3-4]。微生物轉化法[5]生產天然2-苯乙醇不僅可以滿足市場需求，而且得到的產品安全天然[6]，是合成天然2-苯乙醇工業化新趨勢。

微生物轉化法生產天然2-苯乙醇的菌種主要有酵母菌、真菌和細菌[7-8]。合成2-苯乙醇代謝途徑主要有3 條，即艾氏途徑、苯乙胺途徑和從頭合成途徑（圖1）[9]。目前，研究和應用最廣泛的是酵母菌，如釀酒酵母、馬克斯克魯維酵母、乳酸克魯維酵母、異常威克漢姆酵母等[10-13]。酵母菌通常以L-苯丙氨酸為底物，通過艾氏途徑合成2-苯乙醇。此外，真菌如米曲霉等可通過艾氏途徑和苯乙胺途徑合成2-苯乙醇[14]。細菌合成2-苯乙醇的報道較少，有研究顯示腸桿菌屬（Enterobactersp.）細菌能通過從頭合成途徑合成2-苯乙醇[15]。由于細菌具有生長速率快、無需以L-苯丙氨酸為底物合成2-苯乙醇等優點，可降低生產成本，因此具有應用潛力[16]。

圖1 微生物合成2-苯乙醇的代謝途徑Fig. 1 Metabolic pathway for biosynthesis of 2-phenylethanol in microorganisms

本研究從土樣中分離篩選出1 株腸桿菌，該菌株不僅對2-苯乙醇有一定耐受，且可合成2-苯乙醇。從基因序列分析和生物轉化實驗兩個層面對該菌株合成2-苯乙醇的代謝途徑進行研究。可為天然2-苯乙醇的工業化生產提供優良的出發菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土壤樣品采集自上海海灣森林公園不同種類花的根部。

細菌基因組DNA快速抽提試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；HBI腸桿菌科細菌生化鑒定試劑盒 青島海博生物技術有限公司；L-苯丙氨酸、2-苯乙醇、苯乙醛、苯丙酮酸 美國Sigma公司；其余試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

GC6890-5973MS氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用儀、4890氣相色譜儀、1260液相色譜儀 美國Agilent公司；Nicolet 670傅里葉紅外光譜分析儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；UNIC7200紫外-可見分光光度計 上海旦鼎國際貿易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的篩選與鑒定

1.3.1.1 菌株的篩選

在超凈工作臺上稱取采集的土樣各5 g，分別加入含有100 mL無菌水的三角瓶中，在30 ℃、250 r/min條件下富集培養48 h。用無菌生理鹽水將富集菌液稀分別釋至10-4、10-5、10-6、10-7、10-8五個梯度，每個稀釋度取500 μL涂布于肉膏蛋白胨（Luria-Bertani，LB）固體培養基上，30 ℃培養至長出菌落。挑單菌落反復劃線培養至菌落形態單一。將各單菌落轉接LB液體培養基，30 ℃培養24 h，取500 μL分別涂布于含6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0 g/L 2-苯乙醇的LB固體培養基上，30 ℃培養3～5 d。挑取能在含2-苯乙醇LB固體培養基上生長的單菌落，按1.3.3節方法發酵培養并按1.3.4所述方法提取發酵產物。通過GC-MS檢測樣品中2-苯乙醇含量，方法見1.3.5節。所有實驗重復3 次。

1.3.1.2 16S rDNA鑒定

篩選獲得的菌株接種至LB培養基，37 ℃、250 r/min條件下培養24 h。用細菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取基因組，用細菌16S rDNA通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’）進行PCR擴增[17]。擴增產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司完成16S rDNA測序。測序結果上傳至美國國立生物技術信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）進行BLAST比對，并用MEGA 5.1軟件通過鄰接法構建系統發育樹。

1.3.1.3 革蘭氏染色和生理生化鑒定

篩選獲得的菌株進行革蘭氏染色并鏡檢觀察菌體形態。按HBI腸桿菌科細菌生化[18]鑒定試劑盒使用手冊檢測，并根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》[19]進行生理生化鑒定。

1.3.2 基因組測序及序列分析

按1.3.1.2節步驟提取篩選獲得的菌株基因組并送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行基因組測序[20]。利用美吉生物云（https://www.i-sanger.com/）進行序列組裝與注釋。利用KEGG數據庫（https://www.genome.jp/kegg/pathway.html）分析2-苯乙醇合成途徑。

1.3.3 菌株發酵培養

挑取斜面保藏菌株接種于50 mL LB培養基中，在30 ℃、250 r/min條件下培養24 h。按5%接種量轉接至發酵培養基[21]（L-苯丙氨酸3.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，磷酸氫二鉀3.0 g/L，硫酸鎂1.0 g/L，pH 7.0），相同培養條件下發酵48 h。

1.3.4 2-苯乙醇的提取

發酵液于8 000 r/min離心10 min。上清液加入二氯甲烷進行萃取，體積比為1∶1。萃取30 min后取有機相，用0.22 μm有機相濾膜過濾并收集濾液。

1.3.5 2-苯乙醇檢測

GC檢測2-苯乙醇條件：色譜柱：Agilent色譜柱19091S-963（60 m×250 μm，0.25 μm）；進樣口溫度250 ℃；升溫程序：初始柱溫50 ℃，以3 ℃/min升溫至140 ℃，140 ℃保持5 min。載氣（He）流速1.0 mL/min，分流比20∶1，進樣量1 μL。

GC-MS檢測2-苯乙醇方法：GC條件：色譜柱及進樣溫度與上述方法相同；升溫程序：50 ℃保持1 min，以5 ℃/min升溫至230 ℃，230 ℃保持10 min；載氣（He）流速1.0 mL/min；進樣量1 μL；分流比20∶1。MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；母離子m/z122；激活電壓0.8 V；傳輸線溫度250 ℃；電子倍增電壓1.3 kV；掃描范圍m/z20～500。

2-苯乙醇采用外標法定量。配制不同質量濃度的2-苯乙醇（0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 g/L）標準品，在上述GC條件下作2-苯乙醇標準曲線。

1.3.6 紅外光譜檢測

將純化的2-苯乙醇樣品置于紅外光譜儀上，在800～2 500 nm紅外光譜范圍內進行掃描，掃描次數32，分辨率為8 cm-1，探測器為InGaAs。使用空氣作為參考，透射光程1.0 mm，對每個樣品收集3 次光譜，取其平均光譜進一步分析。檢測時環境溫度20 ℃，相對濕度60%。

1.3.7 不同碳源、底物發酵產2-苯乙醇

將菌株接種于50 mL LB培養基，30 ℃、250 r/min培養24 h。無菌條件下將菌液于8 000 r/min離心10 min，并收集菌體。菌體用pH 7.4磷酸鹽緩沖液洗滌3 次后以10%接種量轉接于1.3.3節發酵培養基，其中L-苯丙氨酸質量濃度分別為3.0、6.0、9.0 g/L。將發酵培養基中的L-苯丙氨酸依次替換為葡萄糖（10.0、20.0、30.0 g/L）或苯丙酮酸（3.0、6.0、9.0 g/L）或苯乙醛（3.0、6.0、9.0 g/L），按1.3.3節方法發酵后，按1.3.4節方法提取2-苯乙醇，并按1.3.5節方法定量檢測2-苯乙醇。實驗重復3 次，取平均值。

1.3.8L-苯丙氨酸檢測

高效液相色譜法檢測L-苯丙氨酸濃度。流動相為甲醇-水7∶3，檢測條件為：TC-C18色譜柱（250 mm×4.5 mm），流速1 mL/min，進樣量10 μL，檢測時間15 min，檢測波長254 nm。

L-苯丙氨酸的標準曲線用外標法進行測定：配制不同質量濃度2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 g/L的L-苯丙氨酸標準品，分別通過高效液相色譜檢測獲得相應檢測峰面積。以L-苯丙氨酸峰面積為縱坐標、L-苯丙氨酸標準品質量濃度為橫坐標繪制L-苯丙氨酸標準曲線。

2 結果與分析

2.1 腸桿菌的分離鑒定

從上海海灣森林公園采集的10 份土樣中初篩獲得44 株具2-苯乙醇耐受性菌株。各菌株2-苯乙醇耐受性結果見表1。其中，編號為1～35的單菌落2-苯乙醇耐受質量濃度為1.0 g/L，編號為36～44的單菌落2-苯乙醇耐受質量濃度為2.0 g/L。

表144 株菌株對2-苯乙醇耐受結果Table 1 Tolerance to 2-phenylethanol in 44 strains isolated in this study

進一步通過將初篩獲得的44 株菌置于發酵培養基中進行復篩實驗。在30 ℃、250 r/min條件下培養48 h后。取樣通過GC分別檢測L-苯丙氨酸和2-苯乙醇含量，以此評估44 株菌株產2-苯乙醇能力。其中40號菌2-苯乙醇質量濃度最高，達到0.52 g/L（表2）。

經過比較分析各菌株產2-苯乙醇能力，最終選擇篩選獲得的40號菌株產2-苯乙醇0.52 g/L且對2-苯乙醇耐受質量濃度達到2.0 g/L的細菌菌株。顯微鏡鏡檢結果表明，該菌細胞呈直短桿狀，大小0.6～1.0 μm×1.5～3.0 μm，革蘭氏染色陰性（圖2A）。克隆該菌株16S rDNA（GenBank No. MG554655），并對測序結果進行BLAST分析和構建系統發生樹（圖2B），結果表明該菌株與腸桿菌屬相似性達到99.0%[22]，初步確定該菌株屬于腸桿菌屬。

圖2 腸桿菌革蘭氏染色顯微圖（A）及其系統發生樹（B）Fig. 2 Gram staining (A) and phylogenetic analysis (B) of Enterobacter sp. MF024

進一步根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》[19]進行生理生化鑒定，包括碳源同化、氮源同化和其他特征等實驗。以大腸桿菌DH5α為對照，結果顯示該菌具有典型的腸桿菌屬細菌生理生化特征（表3），因此確定該菌屬于腸桿菌屬，命名為Enterobactersp. MF024。

表3 生理生化實驗結果Table 3 Physiological and biochemical experiment results

2.2 Enterobacter sp. MF024菌株合成2-苯乙醇產物的鑒定

對篩選獲得的Enterobactersp.MF024以3.0 g/LL-苯丙氨酸為唯一氮源生物轉化48 h后，提取發酵液中2-苯乙醇進行GC-MS分析。如圖3所示，在相同檢測條件下，Enterobactersp.MF024發酵液中提取的2-苯乙醇出峰時間為29.705 min（圖3A），與2-苯乙醇標準品（圖3C）的出峰時間一致。由MS結果可知，Enterobactersp.MF024發酵液中提取的樣品在m/z122出現吸收峰，為2-苯乙醇的碎片峰；在m/z91出現強吸收峰，為苯甲基的碎片峰（圖3B）[4]。該結果與2-苯乙醇標準品（圖3D）的各個峰一致。該發酵條件下2-苯乙醇產量為1.15 g/L。

圖3 發酵液GC-MS鑒定結果Fig. 3 GC chromatograms and mass spectra of 2-phenylethanol standard and 2-phenylethanol in fermentation broth

進一步利用紅外光譜法分析Enterobactersp. MF024發酵液中提取的2-苯乙醇樣品（圖4）。醇C—O鍵在1 260～1 000 cm-1有強吸收峰；在1 650～2 000 cm-1出現C—H和C＝C鍵的面內振動的泛頻峰強度都很弱，可以判斷是苯環的一取代物。在3 650～3 200 cm-1處為2-苯乙醇中O—H鍵的低頻峰；2 940～2 970 cm-1處為—CH2—的吸收峰。該結果都與2-苯乙醇標準品特征峰一致。

圖42 -苯乙醇紅外光譜檢測結果Fig. 4 Infrared spectra of 2-phenylethanol standard and 2-phenylethanol in fermentation broth

2.3 Enterobacter sp. MF024菌株基因組中參與2-苯乙醇合成途徑關鍵基因分析

對Enterobactersp. MF024菌株基因組進行測序，該菌基因組大小為4 278 063 bp，共編碼4 512 個基因，基因平均長度是948.15 bp，N50值為577 909 bp （GenBank No. VCBB00000000）。通過KEGG數據庫比對，在Enterobactersp. MF024菌株基因組中發現了參與艾氏途徑以L-苯丙氨酸為底物合成2-苯乙醇的轉氨酶（基因aspC、hisC、tyrB）、苯丙酮酸脫羧酶（基因pdc）和乙醇脫氫酶（基因adhP、adhE）[23]。此外，發現了該菌的aroF、aroB、aroQ、aroE、quiA、aroK、aroA、aroC、pheA和tryA等10 個基因編碼的酶參與了2-苯乙醇從頭合成途徑[24]。

2.4 Enterobacter sp. MF024菌株中2-苯乙醇合成途徑的確定

由于微生物可通過從頭合成途徑、艾氏途徑和苯乙胺途徑3 個途徑合成2-苯乙醇（圖1），本研究對Enterobactersp.MF024菌株的2-苯乙醇合成途徑進行分析。生理生化檢測結果（表3）發現，該菌L-苯丙氨酸脫羧酶為陰性，此酶為L-苯丙氨酸催化生成苯乙胺的關鍵酶。該酶的缺失表明Enterobactersp.MF024菌株無法通過苯乙胺途徑合成2-苯乙醇。

在艾氏途徑中，以L-苯丙氨酸為唯一氮源，依次生成苯丙酮酸和苯乙醛兩種中間產物，最終生成2-苯乙醇[7]。從頭合成途徑則無需添加L-苯丙氨酸，以葡萄糖為唯一碳源，通過一系列代謝途徑后，依次合成苯丙酮酸和苯乙醛，最終生成2-苯乙醇。因此，在前期以L-苯丙氨酸為底物的發酵實驗基礎上，分別以苯丙酮酸、苯乙醛為底物，對Enterobactersp.MF024菌株進行發酵培養，進一步驗證艾氏途徑。此外，不添加底物而以葡萄糖為唯一碳源進行發酵培養，以驗證從頭合成途徑。由圖5 GC分析結果可知，無論是以苯丙酮酸、苯乙醛為底物發酵，還是以葡萄糖為碳源進行發酵，其產物均在29.704 min處有2-苯乙醇峰出現。MS結果進一步表明發酵產物都有2-苯乙醇的特征離子峰（m/z122、91）。因此，Enterobactersp.MF024菌株既能通過艾氏途徑，又能通過從頭合成途徑合成2-苯乙醇。

圖5 各底物發酵液的GC-MS鑒定結果Fig. 5 GC-MS identification of 2-phenylethanol in fermentation broths with various substrates

對Enterobactersp.MF024菌株兩條2-苯乙醇合成途徑的合成效率進行分析。當分別以10.0、20.0 g/L和30.0 g/L的葡萄糖為唯一碳源發酵48 h后（圖6A），得到2-苯乙醇質量濃度分別為0.45、0.49 g/L和0.56 g/L。因此，在一定范圍內，隨著葡萄糖初始質量濃度的提高，2-苯乙醇產率相應提高。當分別以3.0、6.0 g/L或9.0 g/L的L-苯丙氨酸為唯一氮源發酵48 h后（圖6B），2-苯乙醇質量濃度分別為1.02、1.07 g/L和1.15 g/L。因此，在一定范圍內，隨著L-苯丙氨酸初始質量濃度的提高，2-苯乙醇的產率相應提高。當分別以3.0、6.0 g/L或9.0 g/L的苯丙酮酸為底物發酵48 h后（圖6C），2-苯乙醇質量濃度分別達到0.35、0.39 g/L和0.41 g/L。當分別以3.0、6.0 g/L或9.0 g/L的苯乙醛為底物發酵48 h后（圖6D），2-苯乙醇質量濃度分別達到1.63、1.68 g/L和1.75 g/L。由于苯丙酮酸與苯乙醛為從頭合成途徑和艾氏途徑的中間產物，分別以兩者為底物發酵時Enterobactersp. MF024菌株均能合成2-苯乙醇，且隨著底物濃度的提高，2-苯乙醇產量相應提高，進一步表明該菌具備兩種合成途徑產2-苯乙醇的能力。

圖6 2-苯乙醇合成效率結果Fig. 6 Synthetic efficiency of 2-phenylethanol with glucose as carbon source, L-phenylalanine as nitrogen source and different substrates

自20世紀80年代艾式途徑報道以來，微生物轉化法生產2-苯乙醇的研究取得了很大發展。2-苯乙醇微生物合成途徑主要有3 條。其中，報道最多的是酵母菌以L-苯丙氨酸為唯一氮源，通過艾氏途徑生產2-苯乙醇[25]。為提高酵母菌產2-苯乙醇產量，Etschmann等[6]用馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）CBS 600發酵41 h后獲得2-苯乙醇0.89 g/L。徐崢等[26]用紫外誘變法選育釀酒酵母2-苯乙醇高產菌株，其2-苯乙醇產量達到3.55 g/L。汪琨等[27]優化釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CWY 132的培養條件后，其生產2-苯乙醇產量提高至4.1 g/L。田勛[20]經過對釀酒酵母細胞輔因子（NADH/NAD+）調控的研究，利用連續發酵85 h后積累獲得2-苯乙醇15.1 g/L。黃筱萍等[28]利用S. cerevisiaeH003雙罐連續補料發酵144 h后，通過原位產物分離技術獲得2-苯乙醇產量達29.86 g/L。綜上，增加2-苯乙醇產率的改進方式主要集中在合成途徑、遺傳修飾和代謝工程方面[29]。雖然酵母菌可通過艾氏途徑從L-苯丙氨酸高效合成2-苯乙醇，但L-苯丙氨酸的添加提高了生產成本，因此限制了其工業生產規模。

從頭合成途徑產2-苯乙醇是以葡萄糖為唯一碳源，通過苯丙酮酸途徑（即莽草酸途徑）生成苯丙酮酸，苯丙酮酸再代謝為2-苯乙醇。苯丙酮酸途徑可聯系碳水化合物的代謝與芳香族化合物代謝，可直接由碳水化合物（例如葡萄糖）為底物代謝生產2-苯乙醇，無需添加L-苯丙氨酸，降低了生產成本[30]。目前報道通過該途徑合成2-苯乙醇的菌種較少，僅有Zhang Haibo等[15]篩選到Enterobactersp. CGMCC5087可通過從頭合成途徑發酵24 h后，生成0.1 g/L 2-苯乙醇。本研究分離篩選獲得了1 株具備從頭合成途徑和艾氏途徑生產2-苯乙醇的菌株，且從頭合成途徑產2-苯乙醇產量是目前已報道的菌株的5 倍。通過菌種誘變篩選和基因工程改造方法可進一步提高Enterobactersp. MF024菌株從頭合成途徑的2-苯乙醇產量，降低成本，為天然2-苯乙醇的工業化生產奠定了基礎。

3 結 論

本研究在環境土壤樣品中分離篩選到1 株可生產2-苯乙醇且對2-苯乙醇有一定耐受能力的新菌株Enterobactersp. MF024。基因組序列分析表明該菌存在從頭合成途徑和艾氏途徑的所有關鍵酶編碼基因。2-苯乙醇生物轉化實驗進一步驗證了Enterobactersp. MF024具備這兩種2-苯乙醇合成途徑，且2-苯乙醇產量分別達到0.56 g/L和1.15 g/L。研究為天然2-苯乙醇的工業生產提供了優良的出發菌株。