油茶籽油甾醇存在形態及其在精煉和貯藏過程中動態變化分析

賈文聰，方恩華，吳易峰，徐敦明，王曉琴,*

（1.華僑大學化工學院，福建 廈門 361021；2.華僑大學 油脂及天然產物研究所，福建 廈門 361021；3.廈門海關技術中心，福建 廈門 361013）

植物甾醇是一種結構類似環狀醇的天然活性物質，是構成細胞膜及細胞器的重要組成成分[1-2]。其來源于植物果實（種子）油脂以及松科樹木的樹油[3-5]，具有抗炎、抗腫瘤、免疫調節、降低膽固醇、延緩動脈粥樣硬化及預防心腦血管疾病等功能[6-10]。植物甾醇以游離和結合態2 種形式存在，其中結合態甾醇包括甾醇脂肪酸酯、甾醇酚酸酯、甾基糖苷以及酰化甾基糖苷[11-12]。通過酯化結合態甾醇改善其乳化性[13]，可通過減少膽固醇的吸收降低低密度脂蛋白膽固醇（減少7%～10%）[14-15]，降低血液總膽固醇效果比游離甾醇更佳[16]。

植物油作為人類攝取甾醇的主要來源，目前分析工作通常先將油脂進行皂化或酸/堿水解，然后再分離檢測，測得游離態和甾醇酯的含量之和[17-20]，未能區分游離和結合態甾醇。研究者已經開始注意到這個問題，開展了植物油甾醇存在形態分析，例如，芝麻油、橄欖油、棉籽油中游離甾醇占54%～85%，而菜籽油、玉米油、花生油游離甾醇僅占32%～44%[21]。大豆油中游離甾醇總含量為3 500.20 mg/kg，包括菜籽甾醇、蕓薹甾醇等14 種游離甾醇[22]。蓮子油甾醇主要以結合態存在，含量為10.76～11.72 g/100 g[23]。可見，不同植物油甾醇游離和結合態分布存在明顯差異，存在形態分析不可忽略，分析測定不同存在形態甾醇的組成含量對于準確評價油脂品質十分必要。

油茶籽油，又名茶籽油、山茶油，是由山茶屬（CamelliaL.）油茶組（sect.oleifera）和紅山茶組（sect.camellia）植物種子制備而成的油脂[24]。油茶籽油是我國大力發展的木本食用油，也是聯合國糧農組織推薦的健康食用油[25]。甾醇作為油茶籽油中重要的功能物質，已成為國際食品法典委員會食用植物油標準[26]重要內容。油茶籽油甾醇分析工作已有報道，如檢測到麥角甾醇和香葉基芳樟醇[27]；Δ7-豆甾烯醇和Δ7-燕麥甾烯醇[28]也被檢出，但均未進行絕對定量分析。本課題組已對油茶籽油11 種甾醇開展了定性定量工作，測得總甾醇含量為4 979.06～6 266.15 mg/kg，主要甾醇化合物包括羊毛甾醇、β-香樹脂醇、環阿屯醇等[29]。然而，油茶籽油甾醇分析工作較為有限，存在形態等進一步深入研究工作目前鮮見報道。

因此，本實驗采用氣相色譜-質譜聯用技術對國內主要油茶籽油產品甾醇存在形態進行分析，并研究精煉工藝和貯藏過程對油茶籽油不同存在形態甾醇的影響，結合主成分分析（principal component analysis，PCA），揭示油茶籽油甾醇組成及存在形態特征及其影響因素，旨在為建立油茶籽油甾醇數據庫和完善油茶籽油相關質量標準提供基礎數據，同時為指導生產加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

國內主要油茶籽油產品為廠家直購；所用毛油為福建寧德地區采籽低溫壓榨；精煉實驗模擬常規生產工藝，包括脫酸油、脫水油、脫蠟油、脫臭油；膽甾烷醇（純度＞99%，色譜級） 北京索萊寶生物科技有限公司；正己烷（色譜級），正己烷、乙醇、乙醚、氫氧化鉀、無水硫酸鈉（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

中性氧化鋁柱（1.5 cm×25 cm）、SPE固相萃取柱（500 mg/6 mL Pro Elut Silica） 北京迪馬科技有限公司；BS 2202S電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司；R215旋轉蒸發儀、B491恒溫水浴鍋、V70真空泵瑞士BUCHI公司；QP2010氣相色譜-質譜聯用儀（配有NIST14S.LIB譜庫） 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 結合態甾醇的提取分離

參考ISO 12228∶1999[30]及Xu Baocheng等[31]的方法，并進行如下改進。取250 mg油樣于50 mL燒瓶中，用25 mL正己烷溶液溶解，加入600 μL膽甾烷醇（1 mg/mL）內標，混勻備用。稱取1.0 g無水硫酸鈉加到SPE柱的上方，然后用10 mL正己烷溶液活化，流速1.5 mL/min，棄流出液；將前述樣品液注入到SPE柱中，流速1.2 mL/min，棄流出液；再用50 mL正己烷-乙醚（95∶5，V/V）進行淋洗，流速控制為1.1 mL/min，收集洗脫液。向洗脫液中加入1 mg/mL膽甾烷醇標準溶液600 μL，再加入50 mL濃度為1 mol/L的KOH-CH3CH2OH溶液并混勻。將混合液置于100 ℃水浴下回流皂化50 min；取出并冷卻至室溫后，吸取上述溶液加于活化好的氧化鋁柱中，先用5 mL乙醇淋洗，再用50 mL正己烷溶液洗提，流速2 mL/min，收集洗脫液。將洗脫液旋蒸至干后，用1 mL正己烷（色譜級）重溶，過0.22 μm有機濾膜于樣品瓶中，置于-20 ℃保存待測。

1.3.2 游離態甾醇的提取分離

參考徐寶成等[22]的方法并進行改進。用50 mL正己烷-乙醚（80∶20，V/V）溶液繼續淋洗1.3.1節中洗提過結合態甾醇的SPE柱，流速控制為1.5 mL/min，收集洗脫液于干燥的燒瓶中。將洗脫液旋蒸至干后，用1 mL正己烷（色譜級）溶解樣品，過0.22 μm有機濾膜于樣品瓶中，置于-20 ℃保存待測。

1.3.3 甾醇的定性定量分析

采用氣相色譜-質譜聯用儀進行油茶籽油中甾醇類化合物分析測定。

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱：Rxi-5Sil MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣：氦氣；載氣流量1.0 mL/min；進樣口溫度300 ℃；檢測器溫度270 ℃；進樣口分流比20∶1；進樣量1 μL；升溫程序：柱溫初始溫度180 ℃，然后以14 ℃/min升溫至250 ℃，最后以2 ℃/min升溫至265 ℃，保持22 min。

1.3.3.2 質譜條件

電子電離源；接口溫度300 ℃；溶劑延遲5 min；離子源溫度300 ℃；電子能量70 eV；掃描時間0.5 s；質量掃描范圍m/z40～600。

1.3.3.3 定量分析

甾醇化合物的定量采用內標法進行分析，根據被測化合物與內標物的色譜峰面積之比計算組分的含量。計算公式如下：

式中：Ax為被測組分的色譜峰面積；As為內標化合物膽甾烷醇的色譜峰面積；ms為內標化合物膽甾烷醇的質量/mg；m為油脂的質量/g。

1.3.4 PCA

采用SPSS 25.0對國內主要油茶籽油產品及精煉、貯藏過程中油茶籽油結合態甾醇和游離態甾醇數據進行PCA，并繪制PCA載荷圖，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 我國主要油茶籽油產品不同形態甾醇分析

2.1.1 結合態甾醇分析

如表1、圖1所示，共檢測到9 種結合態甾醇，不同油茶籽油產品結合態甾醇組分類似，結合態甾醇總含量在2 975.46～5 613.15 mg/kg之間，主要包括羊毛甾醇、β-香樹脂醇、環阿屯醇等。結合態甾醇中，羊毛甾醇含量最高，平均含量為980.91 mg/kg，占總結合態甾醇含量的24.4%；海棠果醇含量最低，平均含量為140.54 mg/kg，占總含量的3.5%。

表1 國內主要油茶籽油產品的結合態甾醇組成（n=3）Table 1 Bound phytosterol composition of camellia seed oil from major producing areas (n = 3)

圖1 結合態甾醇在油茶籽油中的分布Fig. 1 Distribution of bound sterols in camellia seed oil

2.1.2 游離態甾醇分析

如表2所示，我國主要油茶籽油產品中共檢測到9 種游離態甾醇，總含量為24.97～100.33 mg/kg。由表2及圖2可知，各游離態甾醇的相對占比與其結合態不同。游離β-谷甾醇為國內主要油茶籽油產品的共有游離甾醇，且平均含量最高，為17.90 mg/kg，占總游離態甾醇含量的40.0%；游離態環阿屯醇平均含量最低，為0.61 mg/kg，占總游離態甾醇含量的1.4%。除游離態β-谷甾醇含量較高外，油茶籽油其他甾醇幾乎均主要以結合態形式存在。

圖2 游離態甾醇在油茶籽油中的分布Fig. 2 Distribution of free sterols in camellia seed oil

表2 國內主要油茶籽油產品的游離態甾醇組成（n=3）Table 2 Free phytosterol composition of camellia seed oil from major producing areas (n = 3)

可見，我國主要油茶籽油產品共檢測到9 種甾醇，均以結合和游離形態存在，并以結合態為主，總含量為3 072.87～5 713.48 mg/kg，結合態甾醇占總含量的97.4%～99.4%，游離態占0.6%～2.6%，結合態甾醇生理活性優勢如前言所述，這在一定程度上表明油茶籽油可能具有更好的降低膽固醇、預防心血管疾病的作用，與民間生活經驗相符。

2.2 精煉過程中油茶籽油不同形態甾醇組成變化分析

2.2.1 結合態甾醇

從表3可以看出，油茶籽油毛油在精煉過程中，結合態甾醇種類未發生變化，但含量下降了25.1%。其中，脫酸工藝對油茶籽油結合態甾醇含量影響最大，損失率達22.0%。在各結合態甾醇中，鈍葉醇含量變化最為明顯，下降了59.4%，這可能和其側鏈雙鍵及位置有關[32]；β-谷甾醇含量受精煉影響最小，含量下降3.6%。由圖3可知，結合態甾醇含量在脫酸過程大幅下降后，在后續脫水、脫蠟、脫臭工序中，含量變化幅度較小。

圖3 精煉過程中油茶籽油不同形態甾醇的含量變化Fig. 3 Changes in contents of free and bound sterols in camellia seed oil during refining

2.2.2 游離態甾醇

由表3可知，油茶籽油游離態甾醇在精煉過程中含量逐漸降低，下降至72.24 mg/kg，降低了94.1%，尤其在脫酸工序中損失最多，游離態甾醇含量在此下降了92.9%。游離態羽扇豆醇含量降低最多，損失率達99.2%，游離態(5α,3β,24S)-豆甾-7-烯-3-醇含量變化最小，下降了89.8%，這可能與甾醇自身結構和含量有關。經后續精煉工序處理后，游離態甾醇含量下降趨勢減小（圖3），這與結合態甾醇的含量變化趨勢一致。

表3 精煉過程中油茶籽油不同形態甾醇組成（n=3）Table 3 Free and bound phytosterol compositions of camellia seed oil at different stages of refining (n = 3)mg/kg

可見，在精煉過程中游離態甾醇較結合態甾醇含量損失更大，幾乎全部損耗，尤其是脫酸工藝。脫酸過程向油茶籽油中加入堿和熱水，由于堿與游離脂肪酸中和生成了鈉皂，游離甾醇與皂水會形成膠團并被轉移到皂腳中[32]。同時，鈉皂作為表面活性劑，帶親水性羥基的甾醇可能在此過程中會被吸附除去[33]，從而使甾醇含量大幅降低。由于甾醇在物理性質上主要表現為疏水性[4]，因此脫水對甾醇的含量影響并不明顯。脫臭過程中，高溫使游離甾醇從中性油中蒸餾出來；但即使在270 ℃和1 Pa條件下，結合態甾醇也很難被蒸餾出來[34]。此外，脫蠟、脫臭時游離甾醇和脂肪酸發生促酯化反應形成結合態甾醇，都導致游離甾醇在精煉工藝中含量損失更大。

2.3 貯藏過程中油茶籽油不同形態甾醇組成變化分析

2.3.1 結合態甾醇

如表4所示，油茶籽油結合態甾醇含量隨貯藏時間的延長而逐漸下降，總含量下降了12.0%。其中，結合態海棠果醇含量下降百分比最大，達28.4%，結合態羊毛甾醇含量下降最少，降低了7.8%。從圖4可以看出，整個貯藏過程中，結合態甾醇的含量變化趨勢較為平緩，表明結合態甾醇在自然氧化過程中較為穩定，這可能與其酯化相連的脂肪酸能抑制甾醇的自由基鏈式反應，減少氧化物羥基甾醇的生成有關[35]。

表4 貯藏過程中油茶籽油結合態甾醇組成（n=3）Table 4 Bound phytosterol composition of camellia seed oil during storage (n = 3)mg/kg

圖4 貯藏過程中油茶籽油不同形態甾醇的含量變化Fig. 4 Changes in contents of free and bound sterols in camellia seed oil during storage

2.3.2 游離態甾醇

游離態甾醇含量在貯藏過程中呈不斷下降趨勢，游離態甾醇總含量下降了40.9%（表5）。游離態羽扇豆醇含量下降最大，降低了46.4%；游離態β-谷甾醇含量變化最小，為35.1%，可能與其側鏈長度和結構中雙鍵個數有關[36]。由圖4可知，游離甾醇含量變化較大，下降幅度大于結合態甾醇。在貯藏期間，游離態甾醇含量下降速率呈現變化，這可能是溫度和光照強度變化導致游離甾醇氧化速率不同。

表5 貯藏過程中油茶籽油游離態甾醇組成（n=3）Table 5 Free phytosterol composition of camellia seed oil during storage (n = 3)mg/kg

在貯藏過程中，油茶籽油結合態甾醇含量下降了12.0%，相對于游離態甾醇的含量損失（40.9%），結合態甾醇表現出更強的氧化穩定性。結合態甾醇比游離態甾醇更加穩定，這可能是因為結合態甾醇連接了與其酯化的不飽和脂肪酸。在自然氧化初期，這些不飽和脂肪酸會先于甾醇劣變，其不飽和鍵對甾醇氧化的C5、C6環氧路徑和C7羥/酮路徑產生抑制作用，從而延緩甾醇氧化[36]。因此，在貯藏過程中結合態甾醇比游離態氧化緩慢，具有更強的氧化穩定性，這一結果與文獻報道一致[37-38]。

2.4 油茶籽油不同形態甾醇PCA

在對我國主要油茶籽油產品、精煉過程中油茶籽油以及貯藏過程中的油茶籽油結合態和游離態甾醇進行測定后，以各甾醇為原始變量，應用PCA法對油茶籽油甾醇主體化合物進行可視化表征，結果如圖5所示。

圖5 油茶籽油結合態甾醇（a）與游離態甾醇（b）PCA荷載圖Fig. 5 PCA loading plots of bound sterols (a) and free sterols (b) in camellia seed oil

2.4.1 結合態甾醇PCA

PCA法常采用方差累計貢獻率確定PC數目。結合態甾醇特征值大于1的PC數量為2，PC1的特征值為5.84，方差貢獻率為64.9%，PC2的特征值為1.28，方差貢獻率為14.2%，前2 個PC累計方差貢獻率為79.1%，即2 個PC解釋了總變異的79.1%，可提取前2 個PC。

選取前2 個PC繪制PCA荷載圖（圖5a），可以看出，羊毛甾醇和環阿屯醇在PC1上得分較高，羽扇豆醇在PC2上得分較高，總方差70.0%以上的貢獻來自PC1、PC2，可見，結合態羊毛甾醇、結合態環阿屯醇和結合態羽扇豆醇對油茶籽油結合態甾醇組成影響較大，是油茶籽油中表現穩定的特征甾醇，這與其在不同來源、精煉和貯藏過程中的變異分析結果相符（表1、3、4），其中結合態羊毛甾醇是油茶籽油最穩定存在的結合態甾醇化合物。

2.4.2 游離態甾醇PCA

在PCA中，游離態甾醇特征值大于1的PC有2 個，PC1的特征值為4.29，方差貢獻率為47.6%，PC2的特征值為3.52，方差貢獻率為39.1%，前2 個PC累計方差貢獻率為86.7%，即2 個PC解釋了總變異的86.7%，故提取前2 個PC進行分析。

將PCA荷載矩陣進行旋轉，如圖5b所示，PC1與β-谷甾醇、鈍葉醇、(5α,3β,24S)-豆甾-7-烯-3-醇高度負相關，PC2與樺木醇、β-香樹脂醇、環阿屯醇高度正相關，每個PC都有與其高度相關的甾醇化合物，這表明該PC基本可以反映與其高度相關甾醇的信息。β-谷甾醇在PC1上得分較高，樺木醇在PC2上得分較高，故游離態β-谷甾醇和樺木醇對油茶籽油游離態甾醇組成影響較大，是油茶籽油特征游離態甾醇，這也在油茶籽油甾醇組成分析結果中得到驗證（表2），同時游離態β-谷甾醇在精煉和貯藏中表現出較好的穩定性（表3、5），是油茶籽油中最穩定存在的游離態甾醇。

結合態羊毛甾醇和游離態β-谷甾醇分別在不同形態甾醇荷載圖主因子上得分最高，對油茶籽油甾醇組成影響最大，是油茶籽油主體甾醇化合物，在油茶籽油不同產品、精煉過程以及貯藏過程中都穩定存在。值得注意的是，游離態甾醇的最穩定物質與結合態不一致，這印證了在油茶籽油成品油、精煉油和貯藏油中，不同形態甾醇中均存在穩定的主體物質，甾醇存在形態不能被忽略。

3 結 論

我國油茶籽油產品甾醇共檢測到9 種，均以結合和游離形態存在，總含量為3 072.87～5 713.48 mg/kg，主要甾醇化合物包括羊毛甾醇、β-香樹脂醇、環阿屯醇、β-谷甾醇。結合態甾醇占97.4%～99.4%，是油茶籽油甾醇的主要存在形式，可以反映油茶籽油甾醇的總體特征，這也表明傳統皂化方法分析預處理的可行性。油茶籽油精煉后，游離態甾醇受影響較大，含量降低了94.1%；結合態含量變化較小，下降了25.1%。其中脫酸對2 種形態甾醇的影響均最大，游離和結合態甾醇含量在此分別損失了92.9%、22.0%。在12 個月貯藏過程中，結合態和游離態甾醇含量分別下降了12.0%和40.9%，結合態甾醇比游離態表現出更強的氧化穩定性。PCA及荷載分析發現，結合態羊毛甾醇和游離態β-谷甾醇是油茶籽油最主要特征甾醇，在油茶籽油不同產品、精煉和貯藏中都穩定存在。可見，油茶籽油游離態和結合態甾醇在精煉、貯藏中表現出不同的變化規律，本實驗補充了油茶籽油甾醇存在形態數據，并研究了來源、精煉和貯藏等因素的影響，為油茶籽油甾醇研究和開發提供了基礎資料和理論依據，同時也打開了油茶籽油甾醇氧化研究的新視角。