蛋白酶處理對脫脂乳感官品質及游離氨基酸的影響

程 嬌，孫 敬，梁肖娜，錢冠林，岳喜慶，鄭 艷

（沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110866）

醫學之父希波克拉底曾指出“牛奶是最接近完善的食物”，牛乳富含的蛋白質不僅可為人類生理活動提供能量與必需氨基酸，還具有較高的營養價值和功能特性，但大量的研究結果顯示，由于牛乳和人乳蛋白成分上的差異性[1]，常會導致過敏性哮喘、鼻炎、皮膚濕疹、消化功能紊亂等疾病[2]，據報道約3%的成年人經歷過對乳制品過敏[3]。因此，在保證牛乳營養成分的基礎上，為滿足現代食品開發與加工的需要，利用酶解技術對牛乳蛋白質進行開發和改性，己成為食品加工行業關注的焦點[4-5]。

其中生物酶解技術對牛乳進行改性，因具有脫敏效率高，反應條件溫和且綠色環保的特點而備受關注[6-8]。酶解處理的牛乳蛋白，在抗原性降低的同時，也會生成大量易于人體吸收的小分子肽及游離氨基酸等物質[9]，并且牛乳蛋白空間結構及一級結構的改變，會引起滋味物質與蛋白質之間的相互作用以及蛋白膠束的改變，進而影響牛乳的感官品質[10]。同時，不同蛋白酶及酶解進程存在差異，也會對牛乳中游離氨基酸及色澤滋味等感官品質產生不同影響。目前，牛乳酶解改性的研究主要以提純的乳清蛋白或酪蛋白為研究對象，考察酶解處理對致敏蛋白抗原性、分子結構及理化性質的影響[11-13]，但是以牛乳為研究對象，考察蛋白酶種類以及酶解時間對牛乳感官品質及游離氨基酸含量的影響，卻少見報道。

本實驗在前期工作基礎上，選取堿性蛋白酶、復合蛋白酶、風味蛋白酶為研究對象，以脫脂牛乳為原料，脫脂處理更利于酶解[14]，擬利用電子舌、氨基酸分析儀等現代儀器感官檢測技術，分析酶解處理對脫脂牛乳色澤、滋味及游離氨基酸含量的影響，以便酶解技術及其產物更好地應用于食品工業中，以期擴大牛乳的食用人群，輔助低敏性乳制品的研發，為實現乳制品的多樣化生產提供原料和技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮脫脂牛乳 遼寧省輝山乳業有限公司；堿性蛋白酶、復合蛋白酶、風味蛋白酶 丹麥Novozymes公司；氨基酸混合標準品 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

DK-98-IIA水浴鍋 美國Finnigan公司；CR21N離心機美國惠普公司；UV-1800紫外-可見光分光光度計 日本島津公司；NS810分光測色儀 中國3nh公司；SA402B電子舌 日本Insent公司；L-8900高效全自動氨基酸分析儀 日本日立高新技術公司。

1.3 方法

1.3.1 脫脂牛乳酶解處理

依據表1酶解條件，水浴加熱至52.5 ℃時，準確量取脫脂牛乳150 mL（蛋白質含量5.25 g）及蛋白酶。蛋白酶添加活力依據表1所示的酶活力-底物比計算，然后依據比活力確定脫脂乳中蛋白酶添加量。分別預熱稱量好脫脂乳和蛋白酶各20 min，將堿性蛋白酶、復合蛋白酶、風味蛋白酶分別加入脫脂牛乳中酶解15、30、60、90、120、180、240 min，到達水解時間后，升溫至中心溫度90 ℃，維持10 min對酶進行滅活，然后迅速冷卻至25 ℃左右室溫后備用。

表1 3 種蛋白酶水解條件Table 1 Hydrolysis conditions of three proteases

1.3.2 水解度測定

采用鄰苯二甲醛法[15]。

1.3.3 蛋白質含量測定

采用考馬斯亮藍法[16]。

1.3.4 干物質含量測定

采用直接干燥法[17]，依據GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》[18]方法進行測定和計算。

1.3.5 色澤測定

將分光測色儀經過校準后，將酶解液導入平皿，放置在背景板上，對樣品進行測定，每組樣品測定3 次。

1.3.6 電子舌測定

電子舌采取人工脂膜傳感器技術，可以客觀地數字化評價樣品的味覺感官指標。將樣品置于電子舌專用測試杯（35 mL）中，對其酸、苦、澀、咸、鮮、甜味等基本味覺及苦味回味、澀味回味、鮮味回味（豐富度）進行測定，取測量數據的3 次平均值進行數據分析。

1.3.7 游離氨基酸測定

取酶解物與0.1%磺基水楊酸溶液以體積比4∶1的比例混勻，制作為樣品，置于4 ℃冰箱靜置60 min后，于4 ℃、10 000 r/min離心5 min，取上清液，將樣品經0.22 μm微孔濾膜后經氨基酸自動分析儀測定。

色譜條件[19-20]：分析柱（60 mm×4.6 mm）柱溫為57.0 ℃，反應柱溫度為135 ℃，泵1流速為0.45 mL/min，泵2流速為0.35 mL/min，進樣量20 μL。紫外檢測器：脯氨酸在440 nm波長處測定吸光度，其他氨基酸在570 nm波長處測定吸光度，根據下式計算游離氨基酸含量：

式中：Ci為游離氨基酸濃度/（nmol/mL）；V為樣品體積/mL；F為稀釋倍數（50）；M為氨基酸摩爾質量/（g/mol）；m為酶解物質量/g。

1.4 數據統計與分析

用Excel、SPSS進行數據整理分析及顯著性檢驗，P＜0.05，差異顯著，采用Origin 2020b軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶處理對脫脂牛乳水解度及蛋白含量的影響

水解度是衡量水解效果的重要參數，決定了水解物的酶解特性[21]，并且研究表明，水解物微觀及宏觀特性的改變取決于酶類型和水解過程，特別是水解時間[22]，實驗考察了脫脂牛乳在堿性蛋白酶、復合蛋白酶、風味蛋白酶作用下，水解度隨時間的變化情況，圖1A結果表明，隨著酶解時間延長，3 種蛋白酶酶解物的水解度逐漸增加，堿性蛋白酶、復合蛋白酶在酶解60 min，風味蛋白酶在酶解90 min時，3 種蛋白酶酶解物的水解度趨于平穩，是由于酶解反應之初，底物含量高，遵循零級反應，水解度呈迅速上升趨勢，隨著酶解時間的延長底物消耗殆盡，酶飽和后遵循一級反應，水解度逐漸趨于穩定，在酶解4 h時，風味蛋白酶水解度（24.61%）＞堿性蛋白酶（10.6%）＞復合蛋白酶（9.51%）。結合圖1B可知，與對照組相比，酶解產物蛋白質量濃度均顯著下降；且隨著酶解時間的延長及水解度的增加，牛乳酶解產物呈現明顯下降趨勢，說明酶解處理會引起蛋白質量濃度降低，并且酶解程度及時間與蛋白質量濃度均呈負相關。

圖1 蛋白酶處理對脫脂牛乳水解度（A）、蛋白含量（B）的影響Fig. 1 Effect of protease treatment on the degree of hydrolysis (A) and protein concentration (B) of skim milk

2.2 蛋白酶處理對脫脂牛乳干物質含量的影響

乳制品中干物質含量是反映牛乳品質及質量的重要指標，同時也是乳制品加工過程中原料奶標準化及保證產品質量的重要依據[17]。從圖2可以看出，與對照組相比，經過蛋白酶處理的脫脂乳，其干物質含量略有減少，但堿性蛋白酶及復合蛋白酶處理組無顯著差異，風味蛋白酶處理組在酶解120 min后顯著下降（P＜0.05），可能是由于酶解處理引起牛乳體系穩定性改變，生成小分子低沸點的水溶性物質，在干燥加熱過程中損失部分干物質。

圖2 蛋白酶處理對脫脂牛乳干物質含量的影響Fig. 2 Effect of protease treatment on the dry matter content of skim milk

2.3 蛋白酶處理對脫脂牛乳色澤的影響

食品色澤是影響消費者購買力的主要因素之一，而原料色澤也是影響終端產品的關鍵因素[23]。從圖3可知，酶解后脫脂牛乳色澤變化明顯。與對照組相比，堿性蛋白酶處理60 min、風味蛋白酶處理30 min后，原料乳特有的乳白色逐漸消失；而復合蛋白酶處理15 min后，其乳白色已基本喪失。此現象可能與脫脂乳中蛋白降解引起的蛋白膠束含量降低及蛋白粒徑改變有關[10]。

圖3 蛋白酶處理對脫脂牛乳色澤的影響Fig. 3 Effect of protease treatment on the color of skim milk

通過分光測色儀，采用CIELAB表示并檢測不同蛋白酶及酶解過程中，脫脂牛乳色澤的變化情況，以脫脂牛乳L*=71.94、a*=-2.50、b*=-3.02為對照標準樣品，其白度大，色澤明亮，呈現綠色，且因脫脂后，脂肪含量變少，呈現藍色[23-24]，首先與對照組相比，由圖4～6可知，在不同時間條件下，經過3 種蛋白酶處理的原料乳，其亮度L*、紅度a*、黃度b*值都出現顯著（P＜0.05）變化，其中L*值均顯著（P＜0.05）下降，其變化與蛋白膠束穩定性有關，變性的蛋白膠束分裂，粒徑減少使脫脂乳的透光性增加，進而導致L*降低[25]，a*（負值）均顯著上升（P＜0.05），堿性蛋白酶b*在120 min前顯著下降（P＜0.05），之后顯著上升（P＜0.05），風味蛋白酶在60 min前顯著下降（P＜0.05），之后顯著上升（P＜0.05），而復合蛋白酶酶解產物在第30 分鐘顯著下降。

進一步分析在蛋白酶酶解過程中，3 種蛋白酶處理的脫脂牛乳隨著酶解時間的變化情況，由圖4可知，隨著酶解時間的延長，亮度（L*值）繼續變暗，堿性蛋白酶、復合蛋白酶、風味蛋白酶分別在酶解120、30、60 min后L*值變化不顯著（P＞0.05）；a*、b*值呈顯著（P＜0.05）增加趨勢，堿性蛋白酶、復合蛋白酶、風味蛋白酶分別在酶解120、60、60 min后a*值變化不顯著（P＞0.05），堿性蛋白酶、復合蛋白酶、風味蛋白酶在120 min后b*值變化不顯著（P＞0.05），說明與脫脂牛乳相比，經蛋白酶處理后，顏色變化明顯，亮度變暗；且隨著酶解時間的延長，亮度繼續變暗，色澤逐漸偏紅、偏黃。在酶解4 h后，3 種蛋白酶水解物之間L*值無顯著差異，風味蛋白酶a*值、b*值顯著大于復合蛋白酶、堿性蛋白酶，說明風味蛋白酶處理對脫脂牛乳色澤影響大于堿性蛋白酶和復合蛋白酶處理。

圖4 蛋白酶處理對脫脂牛乳L*、a*、b*值的影響Fig. 4 Effect of protease treatment on color parameters of skim milk

2.4 蛋白酶處理對脫脂牛乳電子舌味感值的影響

2.4.1 雷達圖及相關性分析

香甜味是脫脂牛乳的主要滋味指標。如圖5所示，與對照組相比，經3 種蛋白酶酶解處理的原料乳甜味值均顯著下降（P＜0.05），豐富度以及鮮味值也略有下降，后味B（苦味回味值）、酸味、澀味、后味A（澀味回味值）則有所上升。這主要是由于酶解促使一些苦味、澀味物質（肽、游離氨基酸）產生，且苦味、后味B（苦味回味值）與甜味之間存在味覺的消殺作用，與甜味值存在的負相關關系如表2所示。

圖5 脫脂牛乳酶解產物電子舌雷達圖Fig. 5 Electronic tongue radar maps of enzymatically hydrolyzed skim milk

表2 電子舌味覺值相關性分析Table 2 Correlation analysis among electronic tongue taste values

如表3所示，酶解時間對脫脂牛乳的滋味也有明顯影響，其中酶解產物后味B（苦味回味值）與酶解時間呈極顯著正相關，苦味與酶解時間呈顯著正相關，甜味與酶解時間呈顯著負相關，引起苦味值的上升，甜味值的衰退。

表3 電子舌味覺值與酶解時間相關性分析Table 3 Correlation analysis between electronic tongue taste values and enzymatic hydrolysis time

2.4.2 主成分分析

主成分分析（princpal component analysis，PCA）以散點圖為基礎，利用向量分析和相關矩陣的分類技術，將每個點代表1 個樣品，點之間的距離代表樣品之間特征差異的大小[26]，可以直觀地判斷不同組分間的差異。為考察不同蛋白酶的酶解過程中滋味物質的差異性，實驗以相同溫度及時間條件，以未經酶解處理的脫脂乳為對照，對測得的滋味物質進行PCA。

由圖6可知，PC1的貢獻率為49.0%，PC2的貢獻率為39.4%，總貢獻率為88.4%，二者總貢獻率超過80%[27]，表明PC1和PC2可代表樣品中不同蛋白酶酶解過程中滋味物質的主要特征，說明電子舌能夠有效區分不同蛋白酶酶解過程中滋味物質的差異。不同蛋白酶水解物與對照組分布在不同區域，且4 組樣品數據均分布在95%的置信區間內，說明3 組實驗組及對照組樣品，在滋味物質組成及含量上存在較大差異。對照組組內聚集性好，說明在相同溫度及時間條件，原料乳滋味物質變化較穩定，且滋味物質主要以鮮甜味為主，經過酶解處理的牛乳，其組內聚集性差，可能是由于酶解的處理引起滋味物質與蛋白質之間相互作用方式發生改變，導致滋味物質變化很大。3 種蛋白酶相比，堿性、風味蛋白酶組內聚集性小于復合蛋白酶，堿性蛋白酶以澀味及澀味回味為主，風味蛋白酶以咸味、苦味及苦味回味為主。復合蛋白酶以酸味為主，苦澀等味覺較低，可能是由于不同蛋白酶的酶切位點不同，導致不同呈味物質的釋放。且3 種酶解產物隨著酶解時間延長，樣品滋味的響應值分布呈現一定趨勢，說明脫脂乳酶解產物滋味的變化與蛋白酶處理及蛋白酶種類有關系，且滋味物質會隨酶解時間變化而呈現規律性變化。

圖6 不同蛋白酶作用下脫脂牛乳酶解產物滋味物質PCA分析結果Fig. 6 Principal component analysis (PCA) plots for taste substances in enzymatically hydrolyzed skim milk

2.5 游離氨基酸分析

2.5.1 游離氨基酸組成及評價

游離氨基酸能夠被人體直接吸收，其含量和成分能夠部分反映出食品的營養價值[28]。表4～6表明，對照組及不同蛋白酶酶解產物中主要檢測到16 種游離氨基酸，且與對照相比，不同蛋白酶酶解產物中總游離氨基酸（total content of free amino acids，TFAA）及必需氨基酸（essential amino acid，EAA）含量呈隨酶解時間延長而持續增加的趨勢。在酶解4 h時，風味蛋白酶酶解產物中TFAA含量最高為628 mg/100 mL，其次是堿性蛋白酶酶解液和復合蛋白酶，分別為289、194 mg/100 mL。風味蛋白酶組中TFAA較其他蛋白酶組高，是由于風味蛋白酶的水解度最大，因此酶解過程中釋放出大量的游離氨基酸，而堿性及復合蛋白酶水解度小，釋放的游離氨基酸總量也低。

表4 堿性蛋白酶酶解產物游離氨基酸含量及組成Table 4 Free amino acid composition of alkaline protease hydrolysate

表5 復合蛋白酶酶解產物游離氨基酸含量及組成Table 5 Free amino acid composition of protamex hydrolysate

對照組中谷氨酸含量最高，這與劉海燕[29]、張蘭威[30]等的發現相同，谷氨酸可以為三梭酸循環中的Q-酮戊二酸提供來源[31]。堿性蛋白酶酶解產物以His、Arg、Lys、Phe、Tyr為主要氨基酸；復合蛋白酶酶解產物以Leu、Arg、Met、Phe、Tyr為主要氨基酸；風味蛋白酶酶解產物以Thr、Arg、Leu、Tyr、Phe為氨基酸。其中His促進鐵吸收[32]，可防止腦損傷[33]，是嬰兒必需的氨基酸；Arg具有抗腫瘤、調節免疫力[34-35]的功能，可通過調節蛋白的轉化來刺激胎兒棕色脂肪細胞前體細胞的生長發育；Lys可提高鈣的吸收及其在體內的積累，加速骨骼生長，增強免疫力，提高智力，促進發育[36-37]，可直接進入腦組織，影響呼吸鏈，為神經細胞的修復和進行正常生理活動提供必要的能量來源；Phe在人體內能合成重要的神經遞質和激素以改善人體的記憶力[38-40]；Tyr具有促進黑色素形成的功能[41]；Leu可以提高肌纖維尺寸的恢復，讓思維更加敏捷；Met參與脂肪的減少和解毒，以及膽堿的合成，能協助脂肪分解；Thr具有增強免疫力和轉變某些氨基酸達到平衡的功能[42]；這些結果為促進乳制品的發展提供了數據。

表6 風味蛋白酶酶解產物游離氨基酸含量及組成Table 6 Free amino acid composition of flavourzyme hydrolysate

2.5.2 游離氨基酸呈味特征分析

游離氨基酸具有呈味閾值低、呈味能力強的特點，其含量和種類會直接影響食品的風味。由圖7可知，對照組中鮮甜味呈味氨基酸占TFAA比例達80.98%，苦味呈味氨基酸占TFAA比例為18.19%。3 種蛋白酶酶解產物中鮮甜呈味氨基酸質量濃度分別為風味蛋白酶（164.557 mg/100 mL）＞復合蛋白酶（28.590 mg/100 mL）＞堿性蛋白酶（25.888 mg/100 mL），占氨基酸總量的比例分別為25.54%、14.70%、8.95%，酶解液中均含有鮮甜味氨基酸，而風味蛋白酶酶解液中鮮甜呈味氨基酸的質量分數最高；酶解液中苦味呈味氨基酸質量濃度分別為風味蛋白酶（446.69 mg/100 mL）＞堿性蛋白酶（256.069 mg/100 mL）＞復合蛋白酶（163.26 mg/100 mL），占氨基酸總量的比例分別為69.31%、89.63%、83.94%，實驗結果表明脫脂乳中鮮甜味氨基酸比例較大，而酶解液中苦味占主導地位，苦味氨基酸的比例幾乎是鮮甜味氨基酸的3～10 倍，這與電子舌測定結果類似，酶解處理會導致鮮甜味下降，苦澀等味上升。其中風味蛋白酶所含鮮甜味氨基酸及其所占比例最高，但其苦味氨基酸含量也極高，相比之下，復合蛋白酶苦味氨基酸含量最少，所占比例略低于風味蛋白酶，鮮甜味氨基酸比例僅次于風味蛋白酶，高于堿性蛋白酶，因此綜合比較復合蛋白酶優于堿性蛋白酶和風味蛋白酶。

圖7 各蛋白酶酶解液呈味氨基酸含量及百分比Fig. 7 Contents and percentages of taste-active amino acids in enzymatically hydrolyzed skim milk

進一步統計鮮味氨基酸、甜味氨基酸和苦味氨基酸在酶解過程中不同酶解液占總呈味氨基酸比例的變化，首先針對鮮味氨基酸：堿性蛋白酶酶解液比例隨著酶解時間的延長先減少后增加，由酶解第15 分鐘的1.71%下降到第60分鐘的最低值1.23%，復合蛋白酶比例呈上升趨勢，風味蛋白酶比例呈先上升后下降又上升的波動趨勢，但最終含量都比脫脂乳低；其次甜味氨基酸的變化情況，3 種蛋白酶解液類似，均呈上升趨勢，但最終含量也均比脫脂乳低；最后針對苦味氨基酸，堿性蛋白酶比例呈減少-增加-減少-增加的波動趨勢，而復合蛋白酶和風味蛋白酶比例均先增加后減少，但最終含量比原乳高，上述結果表明，雖然酶解促使體系中游離氨基酸和呈味氨基酸總體含量增加，但卻更多地向苦味方向發展。

酶解液的滋味強度受呈味物質的含量和閾值共同影響[43]。如表7～9所示，堿性蛋白酶酶解液中Phe、His、Arg在180、180、60 min后的滋味活性值（taste active value，TAV）值均大于1，風味蛋白酶酶解液中His、Arg、Met在第30、120、90分鐘時TAV大于1，說明在此時間段后酶解液具有較強的苦味，相比之下，復合蛋白酶組中苦味氨基酸的TAV均小于1，說明復合蛋白酶組的苦味較堿性、風味蛋白酶而言較弱。但3 種蛋白酶酶解物苦味物質在整體呈味物質TAV中占比均大于70%，這表明苦味是酶解液的主要呈味成分，因此脫苦是下一步需要解決的重要問題。

表7 堿性蛋白酶酶解產物游離氨基酸的TAVTable 7 Taste activity values of free amino acids in alkaline protease hydrolysate

表8 復合蛋白酶酶解產物游離氨基酸的TAVTable 8 Taste activity values of free amino acids in protamex hydrolysate

表9 風味蛋白酶酶解產物游離氨基酸的TAVTable 9 Taste activity values of free amino acids in flavourzyme hydrolysate

3 結 論

本實驗結果表明，在不同蛋白酶及酶解時間處理會引起脫脂乳色澤、滋味等感官特性以及游離氨基酸含量的變化。與未處理的脫脂乳相比，牛乳酶解處理后的白色漸漸消失，透明度增加，色澤偏黃；通過電子舌分析，3 種酶解產物的甜味值顯著下降，豐富度及鮮味值略有下降，酸、苦、澀味指標呈現上升趨勢；PCA可知復合蛋白酶、堿性蛋白酶處理產物與原料乳滋味相近，優于風味蛋白酶產物；此外，酶解產物總游離氨基酸及必需氨基酸含量顯著上升，His、Lys、Phe等含量增加明顯，且苦味氨基酸占據主要呈味氨基酸。綜上所述，酶解處理對脫脂乳感官特性會有一定程度的不利影響，但游離氨基酸含量及組成的變化會提升其營養價值。因此，實驗為后續酶解技術的產品開發提供了感官及游離氨基酸方面的數據支撐和理論依據，且后續需要繼續深入研究功能性營養成分、致敏性及避免色澤、滋味等品質變化的方法，進而保證產品的感官等特性達到市場接受水平，輔助功能性產品及低敏乳制品的開發，以便酶解技術及產物能更好地應用于食品工業中。