UPLC-MS/MS分析京尼平苷酸在大鼠體內的組織分布研究

肖曉燕 馮果,2△ 李瑋,2 許琴 周志容 黃僑宗 任晨晨 彭禮珍

(1.貴州中醫藥大學藥學院，貴州 貴陽 550025；2.國家苗藥工程技術研究中心，貴州 貴陽 550025)

京尼平苷酸為環烯醚萜類化合物，在車前子、杜仲中含量較高，為杜仲中主要有效活性成分之一。研究[1-4]表明京尼平苷酸具有保肝利膽、修復損傷脊髓、提高記憶力、抗炎等多種生物活性。京尼平苷酸為京尼平苷一相代謝產物，兩者結構相似，前者有抗炎活性[5]。目前，京尼平苷酸的研究集中在含量測定、提取純化、生物活性方面，而對其在大鼠體內的組織、血漿分布研究尚有欠缺。因此，本實驗采用UPLC-MS/MS，初步探討口服給藥后，京尼平苷酸在大鼠各組織的分布情況，為京尼平苷酸的臨床應用、劑型研制提供參考，同時也為其他中藥(京尼平苷酸為主要活性成分)的研究提供參考意義。

1 材料與方法

1.1儀器與藥品試劑及動物 儀器：超高壓液相質譜聯用系統Waters Quattro Premier XE/Acquity UPLC(沃特世公司)，質譜聯用系統API 4000 Qtrap，(購于美國應用生物系統公司，包含有ESI和APCI接口離子源，2臺島津LC-20AD泵，Analyst Software 1.5.2色譜工作站，SIL-20AC恒溫自動進樣器，CBM-20A控制器，CTO-20A柱溫箱)，LT1002E電子天平(常熟市天量儀器有限責任公司)，DS113T超聲波清洗機(天津市富城達科技有限公司)、JA2003電子分析天秤(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)、H1650臺式高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，50Hz)。藥品與試劑：京尼平苷酸(Geniposidic acid，北京博易匯科生物技術有限公司，批號：27741-01-1，純度>98%)，新綠原酸(博易匯科生物有限公司，批號：170304，純度>98%)，色譜純甲醇(Fisher公司，批號：180920)，色譜純乙腈(Fisher公司，批號：187255)，甲酸(北京邁瑞達科技有限公司，批號：185326)，二甲基亞砜(DMSO，美國Tedia公司，批號：20180911)，肝素鈉(天津生物化學制藥有限公司，批號：201805)，生理鹽水(貴州天地有限公司，批號：A18091203)，其他試劑均為分析純。動物：SPF級SD大鼠，雄性，體質量(200±20)g，購于湖南長沙市天勤生物技術有限公司，合格證號SCXK(湘)2018-0011。大鼠于室內保持12 h光照，12 h避光循環飼養，給予標準飼料和飲用水，控制室內溫度(25.0±1.0)℃，相對濕度(50.0±10.0)%。

1.2方法

1.2.1標準溶液的配制 京尼平苷酸標準溶液的配制：精密稱取京尼平苷酸對照品適量，少量DMSO溶解后，甲醇/水(20：80)配制成濃度為1.00 mg/mL的標準貯備液，臨用時稀釋，于4℃儲存。內標溶液的配制：取新綠原酸對照品適量，少量DMSO溶解后，甲醇/水(20：80)配制成濃度為100 μg/L的溶液，于4℃儲存。

1.2.2樣品預處理 組織勻漿液的制備：取各組織樣品加液氮研磨，加入3倍組織重量的生理鹽水，渦旋混勻，制得組織勻漿液。組織樣品的處理：移取組織勻漿液50 μL，加入5 μL甲醇溶液，加入200 μL甲醇/乙腈(1：1)溶液，渦旋混合2 min，8 000 r/min，離心15 min，取10 μL上清液，用UPLC-MS/MS進行測定。

1.2.3檢測條件 色譜條件：Phexnomonex F5色譜柱(3.0 mm×50 mm，2.6 μm)，流動相：0.1%FA水(A)-0.1%FA乙腈(B)，梯度洗脫(0～0.50 min，10%B；0.50～2.00 min，60%B；2.00～2.10 min，90%B；2.10～3.50 min，90%B；3.50～3.60 min，10%B；3.60～5.00 min，10%～0%B)，流速0.5 mL/min，進樣量3 μL，進樣器溫度4℃，柱溫為室溫。質譜條件：采用電噴霧離子源(ESI)，負離子模式，離子源參數霧化電壓IS為-4 500.00/+5 500，輔助加熱器GS2為60.0，離子源溫度TEM設定600.0℃，氣簾氣CUR為30.0，霧化氣GS1為50.0，掃描方式為多反應離子監測模式(MRM)，檢測離子對為京尼平苷酸m/z 373.0→123.1，新綠原酸m/z 353.2 → 179.0，碰撞能量分別為57，-24eV。

1.3方法學考察

1.3.1專屬性試驗 取空白組織液50 μL，加入適量京尼平苷酸和150 μL內標溶液，按1.2.2方法處理，在上述檢測條件下，內源性物質不干擾京尼平苷酸及新綠原酸的測定， UPLC-MS/MS譜圖見圖1。

注：A.空白胃組織勻漿液；B.空白胃組織勻漿液+京尼平苷酸；C.空白胃組織勻漿液+內標。圖1 大鼠胃組織勻漿液 UPLC-MS/MS圖

1.3.2標準曲線和定量下限 取空白組織液50 μL，加入適量京尼平苷酸標準系列溶液、150 μL內標溶液，按1.2.2方法處理，配成濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100、150 μg/L組織樣品。在上述檢測條件下，記錄峰面積，以京尼平苷酸、濃度(C，μg/L)為橫坐標，京尼平苷酸面積和新綠原酸峰內標峰面積的比值(As/Ai)為縱坐標，用最小二乘法進行線性回歸，結果見表1。表明京尼平苷酸在濃度0.1～150 μg/L線性關系良好，定量下限為0.1 μg/L。

表1 京尼平苷酸在不同組織中的標準曲線數據(μg/L)

1.3.3精密度與準確度試驗 取空白組織液50 μL，加入京尼平苷酸溶液適量、150 μL內標溶液，按1.2.2方法處理，配成濃度為0.2、20、100 μg/L組織樣品，分別在1 d內和連續3 d內進樣測定。京尼平苷酸各組織液樣品的日內、日間精密度和準確度的RSD和相對誤差(RE)結果見表2。表明京尼平苷酸在不同組織中，精密度和準確度均符合要求。

表2 京尼平苷酸在不同組織中的精密度和準確度試驗結果

1.3.4提取回收率和基質效應 提取回收率：配制三個濃度為0.2、20、100 μg/L組織液樣品，每種濃度6份用UPLC-MS/MS進行測定，記錄京尼平苷酸的峰面積A1；取空白組織液50 μL，加入京尼平苷酸溶液適量、150 μL內標溶液，按1.2.2方法處理，配成濃度為0.2、20、100 μg/L組織樣品，記錄峰面積A2；計算組織液中峰面積和不經任何處理峰面積的比值A2/A1，即為提取回收率。組織液基質效應：取不同濃度的京尼平苷酸標準品溶液，加入內標溶液，配制濃度為0.2、20、100 μg/L組織樣品，記錄峰面積A3，將已處理空白組織液配制的標準品溶液峰面積A2與相應濃度的標準品直接進樣的峰面積A3比較，計算基質效應。結果表明京尼平苷酸在不同組織中的提取回收率和基質效應均符合要求。見表3。

表3 京尼平苷酸在不同組織中的提取回收率和基質效應

1.3.5穩定性試驗 取空白組織液50 μL，加入京尼平苷酸溶液適量、150 μL內標溶液，按1.2.2方法處理，配成濃度為0.2、20、100 μg/L樣品，分別于24 h，1、7、14 d解凍，-20℃冰箱中保存14 d，考察其穩定性，結果京尼平苷酸24 h內、反復凍融三次、-20℃冰箱中保存14 d相對穩定，RSD均小于10.0%。另外，取20 μg/L的質控樣品，分別用空各組織液稀釋20倍，每組6份，每份濃度為1 μg/L，測定結果表明稀釋倍數實驗的精密度的RSD及相對誤差均在10%以內，符合生物樣品分析方法要求。見表4。

表4 京尼平苷酸在不同組織中的穩定性試驗

1.4組織分布實驗 灌胃液的配制：精密稱取京尼平苷酸標準品適量，用生理鹽水溶解并定容，配成濃度為3.0 mg/mL的水溶液。組織樣品的采集：健康SD大鼠10只，體質量(200±20)g，隨機分為3組，每組3只，1只作為空白組，取空白組織；給藥前12 h禁食不禁水，灌胃給藥后(60 mg/kg)，分別在0.5、1.5、3 h腹腔注射3%的戊巴比妥鈉(2 ml/kg)麻醉大鼠，經腹主動脈取血后，分別取大鼠的心、肝、脾、肺、腎、胃等組織，用4℃生理鹽水沖洗干凈，用濾紙吸干，稱重，于—80℃下保存備用。組織樣品的處理按1.2.2方法處理。各組織濃度的計算：各組織中京尼平苷酸的濃度采用以下公式[10]計算：Ct=CsVs/P，其中，Ct代表組織濃度(μg/g)，Cs代表組織液濃度(μg/L)，Vs代表組織液的體積，P代表組織的質量。

2 結 果

實驗結果表明，京尼平苷酸在不同組織中分布差異較大。給藥0.5 h后，各組織中京尼平苷酸的質量分數排序為胃>腎>心>脾>肺>肝；給藥1.5 h后各組織的質量分數排序為胃>心>腎>肺>脾>肝；給藥3.0 h后各組織的質量分數排序為心>胃>脾>腎>肺，肝組織測不到濃度。見表5。

表5 京尼平苷酸在大鼠不同組織中的質量分數

3 討 論

本實驗采用UPLC-MS/MS，研究口服給藥后，京尼平苷酸在大鼠各組織的分布情況。實驗結果表明口服給藥后，京尼平苷酸主要分布在胃和腎組織。京尼平苷酸在不同組織的分布速度有差異，在肝、脾、腎組織中0.5 h達質量分數最大值，肺、心、胃在1.5 h達質量分數最大值。說明京尼平苷酸在肝、脾、腎組織分布速度較快，在0.5 h能達到達質量分數最大值，隨著時間的延長，肝、脾、腎組織中濃度逐漸降低，3.0 h后肝組織未檢測到藥物的存在；而肺、心、胃組織中藥物質量分數在1.5 h達到最大值后也逐漸降低，但胃組織中下降的速度較其它組織快。京尼平苷酸極性大，易溶于親水性溶劑，難溶于親脂性溶劑，研究表明，極性較大的化合物難以透過血—腦屏障到達腦部發揮作用。由于藥物在體內分布復雜、易受其它因素影響，本實驗初步探討口服給藥后，京尼平苷酸在大鼠心、肝、脾、肺、腎、胃幾個重要組織中的分布情況，存在一定的局限性。后續將從不同給藥途徑、京尼平苷酸理化性質、藥理作用等方面，進行藥物代謝動力學研究，以闡明其在體內的動態變化和代謝情況，為其臨床應用及劑型深入開發提供參考。