櫻桃根癌病病原菌鑒定及防治藥劑篩選

田小曼， 李朝紅

(1.楊凌職業技術學院，陜西 楊凌 712100； 2.漢中職業技術學院，陜西 漢中 723002)

0 引言

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試藥劑 0.3%四霉素AS(遼寧微科生物工程有限公司)，80%乙蒜素EC(武漢三農科技開發有限公司)，72%農用鏈霉素WP(成都普惠生物工程有限公司)，46.1%可殺得叁千WG(美國杜邦公司)，80%多菌靈WP(陜西美邦農藥有限公司)，75%百菌清WP(陜西恒田化工有限公司)，喜嘉旺人工樹皮(陜西喜嘉旺生物科技有限責任公司)，極能植皮專家(陜西塞恩農業科技股份有限公司)。

1.1.2 接種材料 番茄植株：將毛粉802的番茄種子用0.5% NaClO表面消毒后投入55℃的水中進行溫湯浸種，播種于經過處理的苗床土壤(自然土和基質土以1∶1的比例混勻，并滅菌)中，番茄苗2葉時移栽，每盆1株，45～50 d后接種處理。胡蘿卜片：將新鮮胡蘿卜切成厚度為1cm的圓片待用。

1.1.3 培養基 MW培養基：甘露醇10 g、0.1%生物素0.1 mL、KH2PO40.3 g、Fe-EDTA 2 mL、NaNO35 g、0.1%結晶紫2 mL、NaCl 0.2g、MgSO4·7H2O 0.1g，加水至1 000 mL。LB培養基：胰蛋白胨10 g、酵母抽提物5 g、NaCl 10 g，加水至1 000 mL。牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏0.5 g、蛋白胨1 g、NaCl 0.5 g、瓊脂 2 g，pH 7.0～7.2，加水至100 mL。3種培養基分別按要求制備及滅菌。

1.1.4 試劑盒 蛋白酶K、DNA提取試劑盒(EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit)、膠回收試劑盒、2×Taq PCR MasterMix及2×Mix(Promegar)，均購自武漢昆泰銳公司。

1.2 方法

1.2.1 病情調查 于2014年11月和2015年7月對西安市灞橋區狄寨村不同種植年限的櫻桃園(每個種植年限隨即挑取3個果園)進行櫻桃根癌病抽樣調查，每個櫻桃園隨機調查50株櫻桃樹。查看樹勢、觀察樹干、枝條是否有癌腫、蟲傷及流膠情況，對樹勢衰弱的植株進行刨根調查，觀察根部有無腫瘤、腫瘤數量、大小情況。根據調查結果計算發病率和病情指數。

病情分級：根據櫻桃樹的樹勢和枝條、根部瘤腫情況，采用4級分級標準[4]。

學生沒有搖臂攝像機、滑動導軌等完善的專業設備，多數采用手持式拍攝，雖然靈活方便、角度多變，但穩定性要求較高。在后期剪輯中，可以利用會聲會影濾鏡，消除搖晃改善畫質。也有的學生架設在三腳架上拍攝，拍攝的畫面固定，一鏡到底，枯燥單調。觀眾觀看視頻時，一般在3-5s的鏡頭畫面之后，視覺興趣就開始下降。因此在后期剪輯時，通常需要利用軟件的修剪、分割等功能，根據景別的不同調整畫面的長度，穿插不同類型的鏡頭。除此之外，還可以利用會聲會影，模擬鏡頭的運動、速度、技巧變化，延續和保持觀眾的視覺興趣。

發病率=調查病株數/調查總株數×100%

病情指數=[Σ(各級病株數×相應病級值)/(調查總株數×最高代表級值)]×100

1.2.2 菌株分離 采集發病嚴重植株枝條上的腫瘤、30 cm深處病株根部的腫瘤及腫瘤根部土壤，置于塑封袋保濕，冰箱-4℃保存，以備分離。

利用組織分離法進行菌株分離[5]。首先沖洗枝條和根部瘤體，刮除瘤體表面老化皮層，用滅菌解剖刀切取1 g新鮮、幼嫩瘤體，用無菌水沖洗干凈瘤體表面，浸泡在8%次氯酸鈉溶液中3 min，轉入75%酒精溶液浸泡30 s，取出后無菌水清洗3次。將消毒處理過的瘤體放置于研缽中研磨搗碎，加入9 mL無菌水靜置浸漬5 min，得到濃度為10-1懸濁液，再利用9 mL的無菌水依次稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5的懸濁液。稱取根際土樣10 g，在火焰旁加入盛有90 mL無菌水(內有30～40粒玻璃珠)的三角瓶中，置振蕩機上振蕩20 min，即得10-1濃度的土壤懸液。再依次稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5的懸濁液。

分別取組織分離和土壤分離的不同濃度的菌懸液100 μL，采用涂布或劃線法接種在MW培養基和牛肉膏蛋白胨培養基平板上，28℃培養箱培養3～5 d，待出現菌落后，采用平板劃線法把不同菌落特征的菌株純化至平板上只出現1種菌落，即為純化菌株，置于4℃冰箱保存。

1.2.3 菌株致病性測定 挑取純化菌株涂抹接種于刺傷處理過的胡蘿片上，圓盤置于盛有無菌濾紙的培養皿內，濾紙下墊有無菌水浸濕的棉球保濕，置于28℃條件培養，接種后每隔1 d觀察和記錄接種胡蘿片的發病狀況。3次重復，以無菌水接種作為對照。另外接種番茄植株考察菌株致病性，番茄植株接種時，先用75%酒精棉球擦拭番茄主莖，用無菌針輕刺接種部位。用無菌棉蘸取經LB搖培24 h的細菌懸浮液包裹在刺傷處48 h后取下，置于28℃條件培養，以無菌棉蘸取滅菌LB接種在刺傷處作為對照，3次重復。接種后每隔1 d觀察和記錄接種部位是否有隆起、腫大或是否腫瘤生成。若接種部位出現明顯發病癥狀的，采用組織分離法分離發病部位菌株是否為接種菌株。

1.2.4 菌株生理生化鑒定和16S rDNA序列分析

1) 生理生化鑒定。參考伯杰細菌鑒定手冊[6]和櫻桃冠癭病病原的分離與鑒定[7]中的生物型病原菌不同表現指標對菌株進行鑒定，包括革蘭氏染色、3-酮基乳糖檢測、耐鹽性生長、35℃生長、Schroth培養基、Kerry & Brisbane培養基、氮源利用、丙二酸鹽產堿、乙醇產酸和檸檬酸鹽利用測驗等。

2)16S rDNA序列分析。提取致病菌株的總DNA，使用通用引物(27F，1492R,正向5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,反向5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)進行PCR擴增。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收片段長度在1 500 bp左右的條帶，送至武漢昆泰銳公司進行測序。獲得的序列用NCBI文庫進行BLAST比對，尋找同源性較高的序列。采用MEGA 5.0軟件中的鄰接法構建菌株與其他相近菌株之間的進化樹。

1.2.5 皿內抑菌活性測定 以分離的根癌土壤桿菌菌株DZ08為靶標，選取生產上常用的殺菌劑進行皿內抑菌活性測定。采用濾紙片抑菌圈法[8]將供試藥劑稀釋成200倍、400倍、800倍、1 000倍、1 200倍和1 600倍稀釋液，分別吸取7 μL不同稀釋液的藥劑浸濕已滅菌、直徑6 mm的圓形濾紙片，在無菌狀態下自然風干后備用。吸取0.2 mL的DZ08菌懸液加入到無菌培養皿中，倒入已融化、溫度50℃左右的LB培養基15 mL，待培養基凝固后，用無菌鑷子夾取含藥濾紙片平鋪于含菌平板上，每皿放3片，每個不同濃度藥劑3次重復，以無菌水作對照。于4℃條件下放置6～8 h，使濾紙片里的藥劑能擴散和滲透均勻，再放于培養箱中28℃培養48～72 h，觀察抑菌圈情況，用十字交叉法測量濾紙片周圍的抑菌圈直徑，以抑菌圈直徑為依據，計算抑菌率、不同藥劑的毒力回歸方程、相關系數和EC50值。

1.2.6 田間藥劑防治試驗 根據試驗結果，選擇抑菌活性較好的藥劑及適宜濃度于陜西省西安市灞橋區狄寨村開展田間藥效試驗。隨機選擇發病樹體，徹底刮除枝干上的腫瘤后，在刮除部位及其外延分別充分涂抹篩選出的抑菌活性較好的藥劑，待第1次涂抹的藥劑稍干后再涂抹2～3次，干后再分別涂抹植物調節劑喜嘉旺人工樹皮和極能植皮專家。每處理3棵樹，每棵樹選擇6個刮除部位，3次重復。以病斑刮除后僅涂抹喜嘉旺人工樹皮或極能植皮專家為對照。

1.3 數據處理

采用SPSS 22.0軟件進行數據統計，用Duncan’s新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 發病情況

從表1看出，樹齡2 a的櫻桃根癌病不發病，但隨著樹齡的增長發病率呈上升趨勢，樹齡超過10 a時發病率達100%，病情指數達80.67。患病樹體不僅在根部形成直徑2～5 cm的腫瘤，在枝干上也形成直徑1～10 cm大小不等、形如花椰菜狀的腫瘤。發病嚴重的樹體腫瘤遍布枝干，將主干圍成一圈，主干表面因腫瘤過多而發生龜裂，皮層裂開，呈黑褐色。

2.2 菌株分離與致病性測定

將從櫻桃枝干和根部瘤體以及根際土壤進行常規組織分離獲得的菌株分離純化，根據其在牛肉膏蛋白胨培養基和MW培養基上的培養性狀，共獲得15株菌落形態圓形、偏白色、中間突起、有光澤、粘稠、邊緣整齊的細菌菌落。其中，從根部瘤體分離出6株(DZ01、DZ02、DZ03、DZ04、DZ05、DZ06)，從土壤中分離出5株(DZ07、DZ08、DZ09、DZ10、DZ11)，枝條上分離出4株(DZ12、DZ13、DZ14、DZ15)。15株菌的菌落形態與土壤農桿菌菌落形態相似。

2.3 菌株的致病性

從圖1看出，將分離得到的15個菌株刺傷接種于胡蘿片上，僅菌株DZ08在接種8 d后，接種部位出現明顯的過度增生現象，其余接種菌株在圓盤上無明顯增生或導致接種部位隆起、腐爛現象。將分離得到的15個菌株刺傷接種于消毒的番茄莖部，也僅有菌株DZ08在接種10 d后于刺傷處出現細小突起，對照和接種其他菌株的番茄莖部傷口愈合，無突起生成。說明分離的15個菌株中僅菌株DZ08具有致病性。

注：a為胡蘿卜清水對照，b為接種菌株DZ08，c為番茄莖部清水對照，d為接種菌株DZ08。

利用接種發病的番茄植株莖部出現的瘤體進行組織分離，獲得的菌株與接種菌株在菌落形態、顯微鏡下鏡檢形態表現一致，從而證明菌株DZ08是根癌病的致病菌。

2.4 致病菌株的生理生化和分子生物學鑒定

2.4.1 生理生化鑒定 對致病性菌株DZ08進行生理生化鑒定結果(表2)表明，菌株DZ08的各個指標與根癌農桿菌生物I型的反應結果一致，由此判定致病性菌株DZ08是生物I型。

2.4.2 分子生物學鑒定 提取DZ08菌株的DNA，用引物進行PCR擴增，將擴增產物進行電泳得到1 500 bp左右的條帶，切膠回收后測序，獲得長度1 100～1 200 bp的序列，在Genbank做BLAST比對分析，以此為依據判斷菌株種類和近源種并建立系統發育樹(圖2)，可知菌株DZ08為土壤桿菌屬(Agrobacteriumtumefaciens)(相似性高于98%)。

2.5 菌株的皿內抑菌效果

從表3看出，80%乙蒜素、0.3%四霉素、72%農用鏈霉素、多菌靈∶百菌清=1∶5及46%可殺得叁千5種藥劑中，80%乙蒜素和0.3%四霉素的不同濃度稀釋液都對土壤農桿菌表現出較強的抑制效果，抑菌圈直徑分別為3.7～29.3 mm和1.6～23.7 mm，乙蒜素的抑菌效果強于四霉素；72%農用鏈霉素1200倍液、1600倍液及46%可殺得叁千和多菌靈+百菌清組合的1 000倍液、1 200倍液、1 600倍液無抑菌效果。說明，0.3%四霉素、80%乙蒜素和72%農用鏈霉素的抑菌效果較好，根據3種藥劑對土壤農桿菌的EC50值(表4)，櫻桃根癌病病原菌的抑菌效果依次為0.3%四霉素>80%乙蒜素>72%農用鏈霉素。

表3 不同藥劑處理根癌農桿菌的抑菌圈直徑

表4 3種藥劑對根癌農桿菌的回歸方程及EC50

2.6 田間藥劑防治效果

從圖4看出，不同藥劑與植物調節劑喜嘉旺人工樹皮組合涂抹刮除櫻桃根癌病腫瘤部位的病斑愈合率為A1B1>A2B1>A3B1>A4B1>A5B1，不同藥劑與植物調節劑極能植皮專家組合涂抹的效果為A1B2>A2B2>A5B2>A3B2>A4B2，各組合的病斑愈合率均高于單獨涂抹植物調節劑喜嘉旺人工樹皮組合和植物調節劑極能植皮專家。說明，乙蒜素和四霉素與2種植物調節劑組合的防效較好，其病斑平均愈合率分別為83.56%和77.2%。

注：A1～A5分別為乙蒜素(1 000倍)、四霉素(800倍)、多菌靈+百菌清(500倍)、農用鏈霉素(500倍)、可殺得叁千(500倍)，B1、B2分別為喜嘉旺人工樹皮和極能植皮專家。

3 討論

對灞橋區狄寨村櫻桃根癌病的田間調查表明，該病發生嚴重，特別是樹齡3 a以上的櫻桃樹，而且由于剛開始發病在枝干上癥狀并不明顯，容易被忽視，到枝條上出現出明顯病狀時，根癌病已較嚴重，防治困難。另外，根癌病菌主要從傷口入侵，可以在患病組織和土壤中越冬，所以在防治中，應該貫徹“預防為主，綜合防治”的指導方針，把栽培技術和抗性品種放在首位，建設新果園前徹底清理和消毒果園，施足底肥，減少病蟲害的發生機率；加強苗木檢疫，剔除有病狀的幼苗，種植之前對苗木嚴格消毒，盡量延緩病害的發生和發展。同時，研制和篩選對根癌病有效的藥劑也能在一定程度上控制病害的進一步擴展，減緩植株的衰弱，延長樹齡，保持櫻桃產量，為果農增加經濟效益[9]。

從灞橋區狄寨村的櫻桃冠癭病病樣本中共分離出15個菌株，僅菌株DZ08為櫻桃根癌病的致病菌，生理生化鑒定為生物I型。劉保友等[10]從煙臺大櫻桃根癌病樣本中分離出23株致病菌株，其中16株為生物II型，其余為生物I型。王志龍等[11]從浙江寧波櫻花根癌病中分離得10株致病菌，7株為生物II型，3株為生物I型。馮瑛等[7]從灞橋區冠癭病根部瘤體中分離出1株根癌農桿菌生物I型菌株，是櫻桃枝條和根產生冠癭瘤的致病菌。生物I和II型都有致病作用，但因不同地區環境條件差異，病原菌的生物型可能不一樣，特別是優勢菌株生物型可能不同。

乙蒜素是一種高效廣譜仿生殺菌劑，植物仿生農藥，其作用機理是與菌體內含硫基的物質作用，影響菌體的正常代謝，從而達到抑菌的效果[12]。乙蒜素兼具植物生長調節作用，能促進萌芽、提高發芽率、增加產量和改善品質[13]。本研究結果表明，乙蒜素對于根癌農桿菌有較好的抑制效果，與乙蒜素對根癌病病原菌有抑菌效果[14]研究結論一致。四霉素又稱梧寧霉素，是放線菌鏈霉菌屬中的不吸水鏈霉菌梧州亞種(Streptomycesahygroscopicuswuzhouensis subspl1371)的發酵代謝物，是一種廣譜的生物殺菌劑。四霉素在發酵過程中可形成多種能被作物吸收利用的微量元素，有提高植物組織愈傷能力、誘導防御酶系活性升高而增強作物抗病能力和優化作物品質[15-16]等功效。目前未見四霉素防治根癌病的報道。研究結果表明，四霉素皿內抑菌和田間防治均有較好的效果，可以將四霉素更多地應用于田間防治中。

植物生長調節劑喜嘉旺人工樹皮和極能植皮專家采用仿人類手術植皮再生的原理，對保護傷口、促進傷口愈合有特效。所以在刮除病斑、殺菌劑涂抹后輔之以調節劑涂抹傷口，能夠使傷口更好更快地愈合，恢復樹勢，避免病原菌的再次侵染。在喜嘉旺人工樹皮和極能植皮專家種涂抹劑的處理中，乙蒜素和四霉素都表現出最好的效果，兩者均適合與藥劑復配使用。

4 結論

對西安市灞橋區櫻桃根癌病田間發生情況調查發現，該病發生嚴重，而且隨著種植年限增加，發病率呈上升趨勢，老樹發病率100%。通過組織分離法分離得到病原菌菌株15株，經生理生化鑒定、分子生物學鑒定和致病性鑒定，具有致病性的菌株為DZ08，是該地區根癌病的主要病原菌，經生理生化反應鑒定為生物Ⅰ型。通過皿內抑菌試驗篩選出針對根癌病的靶標藥劑為80%乙蒜素、0.3%四霉素、72%農用鏈霉素、多菌靈∶百菌清=1∶5及46%可殺得叁千5種，以0.3%四霉素、80%乙蒜素和72%農用鏈霉素的防治效果較好。將5種藥劑進行大田藥效試驗結果表明，5種藥劑涂抹病斑都有一定的治愈效果，其中以乙蒜素、四霉素與植物調節劑喜嘉旺人工樹皮和極能植皮專家組合的效果較好，病斑平均愈合率分別為83.56%和77.2%。