電針調控TXNIP/NLRP3通路介導的焦亡途徑對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的保護作用研究

鄧寒冰， 李春琴， 張 粲， 金祖敏

(1.海南省海口市第三人民醫院針灸理療科， 海南 海口 571100 2.海南醫學院第二附屬醫院針灸科， 海南 海口 571100 3.云南中醫藥大學推拿基礎教研室， 云南 昆明 650500 4.貴州省織金縣中醫院治未病科， 貴州 畢節 552100)

新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic ischemic brain damage，HIBD)為圍生期窒息等引起的腦血流分布不平衡、腦動脈供血減少所致的病理損傷，可造成癲癇、腦癱等神經功能障礙性后遺癥，嚴重者導致新生兒死亡[1]。HIBD涉及炎癥、自噬、氧化應激等機制參與，其中炎癥所致神經細胞破壞及死亡為HIBD繼發后遺癥難以治療的原因[2]。硫氧還蛋白互作蛋白(thioredoxin interacting protein，TXNIP)為硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)的內源性抑制劑，可抑制Trx清除活性氧的抗氧化功能，導致Nod樣受體蛋白3(Nod-like receptor protein 3，NLRP3)炎性途徑的激活，誘導細胞焦亡，是導致神經元凋亡的關鍵機制之一[3]。NLRP3炎性小體在HIBD大鼠中處于活化狀態，可能介導缺氧缺血引起的神經元細胞病變，參與HIBD發生與發展[4]。而抑制TXNIP/NLRP3信號通路，可減輕腦缺血所致神經炎癥，改善HIBD新生大鼠細胞炎性焦亡，減輕腦損傷[5]。電針為傳統醫學針灸的一種形式，被應用于癲癇、腦血管意外后遺癥、神經官能癥等疾病的治療，臨床及動物研究顯示，電針對腦卒中患者和腦缺血缺氧大鼠的神經功能均有明顯改善作用[6]，可減輕神經細胞炎癥及凋亡等，然而其具體機制不清楚。本研究從TXNIP/NLRP3介導的細胞焦亡途徑為切點，探討電針是否能通過調控TXNIP/NLRP3細胞焦亡通路減輕HIBD所致腦損傷。

1 材料與方法

1.1動物:新生7日齡SD大鼠，SPF級，體重(14±2)g，購自江蘇兆生源生物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK(蘇)2018-0014，動物使用許可證號：SYXK(蘇)2018-0027，動物質量合格證號：C006317。將新生大鼠在動物房中與孕鼠一起適應飼養一周，本實驗經醫院實驗動物倫理委員會批準。

1.2主要試劑及儀器:TXNIP陰性對照CRISPR質粒(TXNIP NC CRISPR質粒)、TXNIP過表達CRISPR質粒(TXNIP OE CRISPR質粒)(購自上海吉瑪基因公司，批號C03019、C05113)；紅四氮唑(TTC)試劑盒、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、尼氏(Nissl)染色試劑盒、TUNEL檢測試劑盒、大鼠白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-18(IL-18)酶聯免疫吸附試劑盒(購自上海碧云天公司，批號：AF813、P7219-2、C0812、C1092D、SF20117、SF60113)；DAPI試劑盒、蛋白提取試劑盒(購自北京索萊寶科技有限公司，批號：BC4027、BC6028)；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(cleaved-caspase-1)、天冬氨酸蛋白水解酶-1前體(pro-caspase-1)、TXNIP、凋亡相關的斑點樣蛋白(ASC)、NLRP3、β-actin單克隆抗體、羊抗鼠二抗(購自美國Santa cruz公司，批號：SC-1009、SC-1063、SC-2035、SC-50117、SC-50223、SC-00019、SC-00013)；電子針灸儀(四川恒明醫療器械有限公司，型號：HM6805-I)；光學顯微鏡(日本尼康公司，型號：E200)；熒光顯微鏡(北京上光儀器有限公司，型號：XSP-SG-63XF)；電泳儀(濟南童鑫生物科技有限公司，型號：DYCP-31DN)；凝膠成像儀(北京大龍興創實驗儀器股份公司，型號：GelSMART)；酶標儀(上海美谷分子儀器有限公司，型號：SpectraMax iD3)。

1.3實驗方法

1.3.1模型制備、分組及處理:將75只新生大鼠隨機抽取15只作為假手術(Sham)組，其余60只新生大鼠采用改良RICE法復制HIBD大鼠模型[7]，即雙重結扎左頸總動脈并在結扎處之間切斷血管，認真縫合皮膚后保溫恢復1h，而后置于含8%氧氣和92%氮氣的透明盒中缺氧2.5h。HIBD大鼠模型制備成功后采用隨機數字表法分為HIBD組(僅造模，不進行其他處理)、電針組：造模后，根據《靳三針問答圖解》《實驗針灸學》并結合人與大鼠骨密度類比定位穴位，選取腦三針、智三針、顳三針穴位，針刺后連接電針儀行電針治療，1次/d，每次20min，共治療2周，并于每周第1天2%異氟烷吸入麻醉大鼠，借助腦立體定位儀和顯微注射器，在電針治療前6h經腦室注射2L注射無菌生理鹽水，共2次)、電針+TXNIP NC組[電針治療方法同電針組，在電針治療期間，于每周第1天麻醉大鼠后，借助腦立體定位儀和顯微注射器，經腦室注射2 L TXNIP NC CRISPR質粒(1 nmoL/L)，共注射2次]和電針+TXNIP OE組[電針治療方法同電針組，在電針治療期間，于每周第1天麻醉大鼠后，借助腦立體定位儀和顯微注射器，經腦室注射2 L TXNIP OE CRISPR質粒(1 nmoL/L)，共注射2次]，每組15只。Sham組僅暴露左頸總動脈，不結扎和缺氧，造模結束后不進行電針干預和腦室注射。

1.3.2莫里斯水迷宮測試:電針治療后，每組隨機取5只大鼠，根據文獻采用莫里斯水迷宮測試大鼠學習記憶能力[8]，共對大鼠進行7d的測試。每次試驗時，將大鼠在四個象限中釋放點之一放入水中，讓其自主尋找平臺。視頻記錄測試過程中大鼠所有活動，并通過視頻跟蹤系統分析其游泳路徑，記錄其逃避潛伏期。第7天將平臺撤掉，記錄其穿越平臺的次數。所有試驗最多持續60s，若超出60s則將大鼠手動引導至平臺。

1.3.3樣本采集及TTC染色:末次電針治療12h后，各組大鼠均腹腔注射100mg/kg戊巴比妥鈉麻醉處死。隨機取5只，經心臟灌注4℃預冷的磷酸緩沖液，斷頭取腦，借助切片模具自額極將大腦進行冠狀切片(2mm/片)，所有切片均浸沒在2% TTC溶液中，室溫避光孵育20min，轉至4%多聚甲醛溶液中固定，排列整齊拍照，采用ImageJ軟件分析，計算腦梗死體積，腦梗死體積=(5張切片白色梗死面積之和/5張切片總腦面積之和)×100%。其余5只斷頭取腦、摘離出梗死側海馬組織，每只取約2cm3組織塊、切碎后于液氮速凍，-80℃保存待測。剩余海馬組織用4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定后，制備石蠟切片(10m/片)。

1.3.4HE染色及Nissl染色:將1.3.4中部分切片分別采用HE試劑盒和Nissl試劑盒染色，封片后觀察。在光學顯微鏡下觀察海馬神經細胞形態。每組至少觀察6張切片。

1.3.5免疫熒光檢測:對1.3.4中石蠟切片按順序進行脫蠟、檸檬酸鹽緩沖液抗原修復、含0.1% Triton X-100 PBS溶液通透、2%山羊血清封閉、滴加TUNEL試劑盒工作液后，加入cleaved-caspase-1一抗(1∶200)4℃孵育過夜，加入羊抗鼠二抗(1∶500)室溫避光孵育45 min，加入DAPI試劑避光孵育6 min，加入封閉液并封片。放在熒光顯微鏡下觀察細胞焦亡率，細胞焦亡率(%)=(cleaved-caspase-1+TUNEL+DAPI+細胞數量/DAPI+細胞數量)×100%，每組至少10張切片，每個切片觀察5個視野計算平均值。

1.3.6蛋白免疫印跡檢測:研缽粉碎海馬樣品后采用蛋白提取試劑盒提取總蛋白質，BCA法測定濃度，各組取30g煮沸變性，依次進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法轉膜，奶粉封閉。加入一抗cleaved-caspase-1(1∶1000)、pro-caspase-1(1∶2000)、TXNIP(1∶1000)、ASC(1∶2000)、NLRP3(1∶2000)和β-actin(1∶2500)一抗4℃過夜孵育。第2天用1×Tris緩沖液洗膜3次，將膜放入相應二抗(1∶5000)中，室溫孵育1.5h，再次洗膜3次后，加入發光液顯影，TANON成像系統采集圖像，并采用自帶軟件分析條帶灰度值，計算蛋白相對表達水平。

1.3.7ELISA檢測:取1.3.5中海馬冷凍樣品，按照ELISA試劑盒說明書進行處理，依次加入工作液、終止液，于酶標儀450nm處檢測各孔吸光值，根據事先制作的標準曲線，計算各大鼠海馬中IL-1β、IL-18水平。

2 結 果

2.1各組大鼠腦梗死體積比較:與Sham組比較，HIBD組腦梗死體積明顯增大(P<0.05)；與HIBD組比較，電針組、電針+TXNIP NC組腦梗死體積減小(P<0.05)；與電針組、電針+TXNIP NC組比較，電針+TXNIP OE組腦梗死體積增大(P<0.05)。見圖1、表1。

表1 各組大鼠腦梗死體積學習記憶能力及細胞焦亡的比較

圖1 各組大鼠腦梗死體積比較(TTC染色)

2.2各組大鼠學習記憶能力比較:與Sham組比較，HIBD組大鼠穿越平臺的次數明顯減少，逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)；與HIBD組比較，電針組、電針+TXNIP NC組大鼠穿越平臺的次數增多，逃避潛伏期縮短(P<0.05)；與電針組、電針+TXNIP NC組比較，電針+TXNIP OE組穿越平臺的次數減少，逃避潛伏期延長(P<0.05)。見表1。

2.3各組大鼠海馬區病理損傷觀察:Sham組海馬區神經細胞排列規則致密，胞核染色均勻，胞質邊界清晰，形態正常；HIBD組神經細胞排列錯亂疏松，胞核皺縮深染，胞質邊界模糊，尼氏小體數量減少；與HIBD組比較，電針組和電針+TXNIP NC組海馬區細胞損傷均明顯改善，尼氏小體數量增多；與電針組和電針+TXNIP NC組比較，電針+TXNIP OE組海馬區細胞損傷加重，尼氏小體數量減少。見圖2。

圖2 各組大鼠海馬組織Nissl染色和HE染色情況(×200)

2.4各組大鼠海馬區細胞焦亡比較:與Sham組比較，HIBD組海馬區cleaved-caspase-1+TUNEL+細胞明顯增多(P<0.05)；與HIBD組比較，電針組、電針+TXNIP NC組海馬區cleaved-caspase-1+TUNEL+細胞減少(P<0.05)；與電針組、電針+TXNIP NC組比較，電針+TXNIP OE組cleaved-caspase-1+TUNEL+細胞增多(P<0.05)。見圖3、表1。

圖3 各組大鼠海馬區細胞焦亡情況(×200)

2.5各組大鼠海馬組織TXNIP/NLRP3通路相關蛋白表達水平比較:與Sham組比較，HIBD組大鼠海馬組織cleaved-caspase-1/pro-caspase-1、ASC、TXNIP、NLRP3蛋白水平明顯升高(P<0.05)；與HIBD組比較，電針組、電針+TXNIP NC組大鼠海馬組織cleaved-caspase-1/pro-caspase-1、ASC、TXNIP、NLRP3蛋白水平降低(P<0.05)；與電針組、電針+TXNIP NC組比較，電針+TXNIP OE組大鼠海馬組織cleaved-caspase-1/pro-caspase-1、ASC、TXNIP、NLRP3蛋白水平升高(P<0.05)。見圖4、表2。

表2 各組大鼠海馬組織TXNIP/NLRP3通路相關蛋白表達水平比較

圖4 各組大鼠海馬組織TXNIP/NLRP3通路相關蛋白情況

2.6各組大鼠海馬組織IL-18 IL-1β水平比較:與Sham組比較，HIBD組大鼠海馬組織IL-18、IL-1β水平明顯升高(P<0.05)；與HIBD組比較，電針組、電針+TXNIP NC組大鼠海馬組織IL-18、IL-1β水平減少(P<0.05)；與電針組、電針+TXNIP NC組比較，電針+TXNIP OE組大鼠海馬組織IL-18、IL-1β水平升高(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠海馬組織IL-18 IL-1β水平比較

3 討 論

雖然圍產期監測及醫療技術取得了重大進步，HIBD仍是導致新生兒死亡和永久性神經系統殘疾的主要原因之一，并且沒有藥物或治療方式能夠持續改善圍產期HIE后嬰兒的長期存活率[9]，因此，尋找新療法成為必要。本研究通過采用改良RICE法復制HIBD大鼠模型，并分析電針對HIBD大鼠模型的作用機制，為HIBD的治療提供參考。海馬為負責學習記憶的主要功能區，外部信號傳遞到神經中樞后在此進行整合，發生損傷可引起學習記憶能力下降，而腦缺血缺氧極易造成海馬區神經細胞炎癥和焦亡。另有研究發現，HIBD患兒的海馬區椎體細胞的生理特性和突觸傳遞功能受到破壞，呈現病理損傷[10]。本研究顯示，與Sham組比較，HIBD組大鼠腦梗死體積增加，穿越平臺的次數減少，逃避潛伏期延長，神經細胞排列錯亂疏松，胞質邊界模糊，數量減少，顯示缺血缺氧可造成新生大鼠腦梗死，導致神經功能和學習記憶能力弱化。已證實，海馬區神經細胞炎癥和焦亡與缺血缺氧導致的腦損傷密切相關[11]，本研究亦發現，與Sham組比較，HIBD組海馬區cleaved-caspase-1+TUNEL+細胞顯著增多，提示缺血缺氧造成新生大鼠海馬區神經細胞炎癥及焦亡，與其腦損傷及學習記憶能力弱化有關。針刺主要通過對人體經絡穴位進行刺激，通過調氣血、通經絡等實現改善臟器功能、治療疾病的目的，具有操作簡單、安全經濟等特點。傳統針刺療法“靳三針”中的腦三針、智三針、顳三針在治療幼兒腦病方面已取得較為肯定的療效。動物實驗亦證明，“靳三針”針刺療法可促進海馬神經元自噬，阻止小膠質細胞活化及炎性壞死，保護神經功能，改善HIBD新生大鼠學習記憶和自主活動能力[12]。電針為針刺的創新與改進，主要在毫針針刺的基礎加以電流刺激，已有研究表明，電針可能為促進腦癱功能恢復的另一種治療選擇[13]。本研究對HIBD新生大鼠的腦三針、智三針、顳三針選穴進行電針刺激，結果顯示，電針治療后，腦梗死體積及逃避潛伏期顯著降低，穿越平臺的次數增多，海馬區神經細胞損傷減輕，伴隨cleaved-caspase-1+TUNEL+細胞減少，表明電針治療可明顯抑制海馬細胞焦亡，減輕腦損傷，提高學習記憶能力。但其作用機制并不清楚。近年研究發現，依賴于炎癥的細胞焦亡為細胞死亡的另一種典型程序，TXNIP∕NLRP3通路通過介導細胞焦亡參與多種缺血缺氧所致器官損傷的發生和發展[14]。正常狀態下，TXNIP與還原型Trx結合，維持其抗氧化能力；缺血缺氧狀態下，機體內氧化應激水平較高，Trx被氧化后TXNIP與之解離，轉而與NLRP3結合并誘導NLRP3炎性小體活化，隨之將pro-caspase-1剪切為具有活性的cleaved-caspase-1，介導細胞腫脹破碎，同時誘導IL-1β、IL-18等炎性因子產生，引起炎癥反應，誘導細胞焦亡[15]。腦缺血再灌注所致神經細胞損傷與NLRP3介導的細胞焦亡密切相關[10]。抑制TXNIP/NLRP3炎性體激活，可使缺血引起的腦梗死和水腫程度降低，組織病理學及神經功能損傷改善。本研究發現，相較于Sham組，HIBD組新生大鼠海馬中cleaved/pro-caspase-1、ASC、NLRP3、TXNIP蛋白及IL-18、IL-1β水平均增加，表明HIBD新生大鼠腦組織中TXNIP/NLRP3焦亡通路被活化。而電針治療后，海馬中cleaved/pro-caspase-1、ASC、TXNIP、NLRP3蛋白及IL-18、IL-1β水平均顯著低于HIBD組，推測電針可降低TXNIP表達，進而抑制NLRP3介導的細胞炎癥及焦亡。為驗證該猜想，本研究采用TXNIP CRISPR激活質粒和電針聯合干預HIBD新生大鼠，結果顯示TXNIP OE CRISPR質粒可逆轉電針對NLRP3焦亡通路的抑制作用及對海馬神經細胞損傷的改善作用，進一步證明電針可能通過抑制TXNIP/NLRP3通路，減輕焦亡，改善神經細胞和腦損傷。綜上，本研究認為電針可能通過抑制TXNIP/NLRP3通路介導的細胞焦亡，減輕神經細胞損傷，改善HIBD大鼠學習記憶能力，然而HIBD涉及的病理過程較為復雜，電針改善HIBD神經損傷的作用可能涉及其他機制，有待進一步探究。