熒光原位雜交檢測HER-2基因擴增和免疫組化技術檢測C-erbB-2蛋白表達情況的比較

陳 煦， 陸定貴

(1.廣西壯族自治區百色市人民醫院病理科， 廣西 百色 533000 2.右江民族醫學院附屬醫院創傷骨科， 廣西 百色 533000)

乳腺癌是目前危害女性健康的常見惡性腫瘤，近年來我國乳腺癌患者數量持續增長，且癌細胞擴展迅速，不及時治療會危及患者生命。臨床早期篩查能夠快速確診是否為乳腺癌，進而為患者治療爭取時間[1,2]。目前基因學檢測技術是乳腺癌篩查的常用方法，Her-2基因檢測是乳腺癌診斷的關鍵，染色體17q12-21.32是Her-2基因的分布位點，在基因序列調控下，生成絡氨酸激酶受體，此受體具有跨膜轉運功能，在受體作用下異源、同源二聚體發生偶聯反應，腫瘤生長信號通路被激活，促使腫瘤生長、癌細胞擴散[3]。Her-2基因監測不僅能診斷癌癥，還能對臨床治療效果進行評估，可見其用途之廣。在Her-2檢驗中，免疫組化(IHC)、熒光原位雜交(FISH)是兩種常用方法，前者在癌癥初篩中比較適用，優點是經濟、操作便捷，但檢測準確性上有一定缺陷，在必要情況下需輔助FISH檢測[4]。本研究旨在探析上述兩種檢測方法的相關性及差異性，詳細報道如下。

1 資料與方法

1.1臨床資料:以98例乳腺癌患者的手術病理切片為檢測對象，切片收集時間：2017年8月至2019年8月。提供手術切除標本的患者年齡范圍30～80歲，平均(51.05±1.50)歲。所有患者的手術切片均經過病理檢驗確定為乳腺癌，其中浸潤性小葉癌、導管癌分別50例、48例。所有標本均采用甲醛(中性)固定，并進行石蠟包埋。

1.2試劑與方法

1.2.1試劑:PV-6000免疫組化試劑盒，由北京欣興唐生物科技有限公司提供；抗人Her-2單克隆抗體，由北京同立海源生物科技有限公司提供。Her-2DNA探針試劑盒、熒光顯微鏡等試驗所需設備，清點試驗設施后進行矯正，準備試驗。

1.2.2FISH檢測:準備甲醛(10%)適量，將切片組織置于甲醛液中，靜置24h固定，作4m切片，置于65℃溫度下烘烤后靜置一晚；準備二甲苯，進行脫蠟反應，直至水化，然后在不同濃度乙醇中依次脫水(100%、85%、70%)，準備去離子水，將脫水后的二甲苯置于其中浸泡3min；準備酸性亞硫酸鈉(30%)進行，在50℃下浸泡切片半h，進行2次洗片操作，將切片置于蛋白酶K溶液中浸泡20min，溫度維持37℃；再次進行洗片，將切片放入準備好的HCL(0.1moL/L)溶液中，靜置10min；制成玻片，在-20℃下預冷，并在不同濃度乙醇中依次作脫水處理，將丙酮在室溫下進入到玻片中，然后晾干；將玻片加熱至56℃，進行封邊處理；標本投入雜交儀，變性處理5min(73℃)，然后維持恒溫37℃過夜，次日洗片，晾干。暗室中用熒光顯微鏡觀察玻片。

1.2.3IHC檢測:將病理組織做成石蠟切片，切下4m，準備二甲苯將石蠟水化，持續進行2min的高壓熱修復；準備PBS沖洗液，連續進行3次沖洗，在恒溫37℃下進行一抗孵育，時間為1h；再次在PBS溶液中沖洗3次，每次2min；準備PV-6000溶液，將切片置于其中孵育20min，保持37℃恒溫。

1.3觀察指標

1.3.1FISH結果判定：隨機觀察一個癌細胞，記錄其中30個隨機的雙色熒光信號，得到橘紅色/綠色比值，比值在1.8以下記為陰性，見圖1;比值超過2.2記為陽性，見圖2。若在1.8～2.2間，需重新計數并判定。

圖1 癌細胞雙色熒光信號陰性

圖2 癌細胞雙色熒光信號陽性

1.3.2IHC結果判定：根據切片染色程度對檢驗結果進行判定，無染色或輕微染色為-,見圖3;細胞染色超過10%但不足中度染色，記為+，見圖4;達到中度染色記為++，見圖5；呈棕黃色為+++，見圖6。

圖3 無染色或輕微染色

圖4 細胞染色超過10%但不足中度染色

圖5 達到中度染色

圖6 呈棕黃色

2 結 果

2.1C-erbB-2蛋白、Her-2基因檢測結果分析:IHC檢測結果顯示，陽性占53例(54.08%)，陰性占45例(45.92%)。FISH檢測結果顯示，陽性占比29例(29.59%)，陰性占69例(70.41%)。以FISH為金標準，IHC檢測為-的符合率為42(93.33%)，+的符合率5(17.86%)，++的符合率11(78.57%)，+++的符合率10(90.91%)。見表1。

表1 C-erbB-2蛋白 Her-2基因檢測結果分析n(%)

2.230-50歲患者檢測結果分析:IHC檢測結果顯示，陽性占29例(58.00%)，陰性占21例(42.00%)。FISH檢測結果顯示，陽性占比16例(32.00%)，陰性占34例(68.00%)。以FISH為金標準，IHC檢測為-的符合率為19(90.48%)，+的符合率4(23.53%)，++的符合率4(66.67%)，+++的符合率5(83.33%)。見表2。

表2 30～50歲患者檢測結果分析n(%)

2.350歲以上患者檢測結果分析:IHC檢測結果顯示，陽性占23例(47.92%)，陰性占25例(52.08%)。FISH檢測結果顯示，陽性占比12例(25.00%)，陰性占36例(75.00%)。以FISH為金標準，IHC檢測為-的符合率為24(96.00%)，+的符合率1(10.00%)，++的符合率7(77.78%)，+++的符合率4(100.00%)。(P<0.05)。見表3。

表3 50歲以上患者檢測結果分析n(%)

3 討 論

Her-2基因是人體17號染色體上的原癌基因，隨著臨床研究的不斷深入，發現Her-2基因與乳腺癌的發生發展、化療、預后等都存在緊密關系[5]。在相關報道中指出，三苯氧胺內分泌療法、CMF化療等方案治療乳腺癌(Her-2基因擴增導致)，效果不甚明顯，且機體呈現出不同程度的抗藥性[6]。對此，有學者提出在系統化療后，給予患者表柔比星、多西他賽等藥物，能夠有效控制患者病情，此外蒽環類藥物在Her-2基因擴增的乳腺癌患者中有較高敏感性，研究顯示此類藥物用于乳腺癌治療能夠有效延長生存率[7]。

無論何種藥物治療乳腺癌，都需要精準的檢測方法以確定是否為乳腺癌患者，早期精確診斷能為患者治療爭取時間，避免癌癥發展到晚期措施治療時機。Her-2基因是目前臨床上檢測乳腺癌細胞的重要方法，IHC、FISH作為效果較為確切的檢測方法，臨床上使用較多，本次研究也對兩種方法進行比較。

IHC主要是對Her-2受體蛋白檢測的一種方法，癌細胞表面的Her-2特異性抗體能被IHC檢測識別出來，進而分析蛋白的表達情況。與FISH檢測相比，此法操作簡單、成本低廉，部分材料能夠重復使用，因此臨床檢測中常用到IHC。本研究顯示，以FISH為金標準，所有患者病理切片IHC檢測為-的符合率為42(93.33%)，+++的符合率10(90.91%)；30-50歲患者IHC檢測為-的符合率為19(90.48%)，+++的符合率5(83.33%)；50歲以上患者IHC檢測為-的符合率為24(96.00%)，+++的符合率4(100.00%)。分析上述結果發現，IHC檢測C-erbB-2蛋白中，陰性(-)、強陽性(+++)具有較高的檢出率與符合率，尤其是50歲以上患者+++檢出率為100%，因此臨床檢測中推薦將無明顯癥狀、或癥狀嚴重患者用IHC檢測。但此方法以Her-2基因的受體蛋白為檢測對象，若標本處理操作不規范，易破壞蛋白質原有結構，加之主觀因素影響，檢測結果存在較大偏差。蛋白質檢測方法畢竟未追溯到癌細胞發生發展的根源，與之相比基因檢測可信度較高。此外，不同年齡段患者IHC檢測符合率也有差異，本研究顯示50歲以上患者IHC檢測符合率要高于30～50歲的患者。

由此本研究提出FISH檢測，其原理為：探針被熒光染料標記，進而將目標核酸片段、探針雜交，從而得到擴增基因序列，通過染色辨別是否患有乳腺癌。FISH檢測技術能夠保證病理組織、細胞結構的完整，通過染色能準確識別Her-2基因擴增序列，有效排除其它癌細胞對檢測的干擾，因此FISH是業界公認的檢測Her-2基因的金標準[8]。與IHC檢測相比，FISH具有明顯的優越性：癌病病灶組織中，DNA穩定性較高，在切片組織包埋、脫水、染色等處理過程中不易受到破壞，且在處理期間樣本敏感性較低；此法能夠通過擴增基因序列，客觀判定陰性、陽性。本次采用雙色熒光信號來鑒別陰陽性，探針與目標基因片段雜交后，置于熒光顯微鏡下，能顯示出兩種顏色的熒光點，Her-2基因片段用橙色熒光染色，剩下片段用綠色熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察到橙色熒光增多，結果記為陽性[9]。本研究結果顯示，以FISH為金標準，所有患者IHC檢測+符合率5(17.86%)，++符合率11(78.57%)，30～50歲患者+符合率4(23.53%)，++符合率4(66.67%)，50歲以上患者+符合率1(10.00%)，++符合率7(77.78%)，反之FISH在++、+++患者中的檢出率較高。由此可見，FISH在檢測Her-2擴增基因方面具有較高的可靠性。

綜上所述，IHC初步篩查C-erbB-2蛋白，-、+++符合率較高，在++、+篩查中IHC符合率較低，建議在IHC篩查基礎上再做FISH篩查，以明確HER-2基因狀態。