基于多重PCR技術同時檢測肉制品中6種動物源性成分

趙志勇,朱少華,趙曉燕,索玉娟,陳愛亮,李曉貝,張艷梅,周昌艷?

(1上海市農業科學院農產品質量標準與檢測技術研究所,上海201403;2農業農村部工程建設服務中心,北京100125;3中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所,北京100081)

肉制品摻假是食品領域一直存在的質量安全問題,也是公眾關注的焦點之一[1-2]。由于肉類品質和價格存在差異,個別企業和商販在利益驅動下,用低價劣質肉冒充高價優質的肉,尤以摻雜異種肉(如豬肉、鴨肉冒充牛、羊肉等)的行為最為常見[3]。近年來,該類摻假事件在國內外屢有發生,引起了社會的廣泛關注。2011年新華網報道,很多大排檔為降低成本通過“牛肉膏”使豬肉變身“牛肉”,江西、福建、廣州及其周邊市場也存在這種狀況。2013年歐洲暴發“馬肉風波”,在瑞典、英國和法國部分牛肉制品中發現了馬肉[4]。2018年,河北河間多個鄉鎮的黑作坊將騾子肉、馬肉、豬肉加工后冒充驢肉出售。這些摻假事件不僅損害了消費者的利益、擾亂了市場秩序,也容易引發民族宗教等問題[5]。另外,摻假產品中經常使用調味劑及調色劑,僅從產品的色澤和氣味上,很難判斷出肉制品中是否添加了其他肉類成分。為了嚴厲打擊肉類產品摻假售假等行為,建立肉制品中動物源性成分鑒別檢測技術顯得尤為重要。

從20世紀80年代開始,國內外就已開展了動物源性成分檢測相關的研究工作[1,6-9]。目前,主要的檢測方法包括:以顯微鏡觀察為基礎的物理方法[10]、以檢測蛋白質為基礎的免疫學方法[8]、以檢測DNA為基礎的分子生物學方法[7,11]、以高效液相色譜技術為基礎的化學方法[12]、以近紅外反射技術為基礎的光譜學方法[13]。其中,聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)具有特異性高、成本較低、操作簡便等優點,已在微生物和動植物的種質鑒別中得到廣泛應用,在肉制品摻假鑒別方面也顯示出良好的應用前景[14-15]。我國政府監管部門已頒布了利用PCR技術鑒定肉源性成分的國家標準和行業標準。然而,這些標準大多針對單種動物源成分進行鑒定,對于確證食品中是否摻雜有多種肉類成分,則需分別鑒定,檢測成本高、操作繁瑣且耗時。本研究旨在建立一種可同時檢測食品中牛、羊、雞、豬、鴨和驢等成分的六重PCR方法,以用于肉制品中6種動物源性成分的同時鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

磁珠法基因組DNA抽提試劑盒和PCR Taq擴增試劑盒(含染料或不含染料)購自生工生物工程(上海)股份有限公司。所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。牛肉(魯西黃牛、和牛、南陽牛和安多牦牛)、豬肉(太湖豬、三元豬、杜洛克豬、良雜豬和沂蒙黑豬)、兔肉和狗肉等由中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所提供。羊肉(崇明白山羊和波爾山羊)、雞肉(白羽雞、三黃雞、烏骨雞和草雞)及草鴨等購自上海屠宰場或大型超市。樣本保存在-20℃條件下。

1.2 儀器與設備

T100 PCR擴增儀(美國Bio-Rad公司),Universal Hood II凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司),Nanodrop 2000C超微量分光光度計(美國Thermo Scientific公司),PowerPac＠basic電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取方法

(1)鹽提取法 稱取肉樣50 mg,加入液氮研磨成粉末,轉移至1.5 mL離心管中,加入400μL裂解液I(10 mmol∕L Tris-HCl,pH 8.0;2 mmol∕L EDTA,pH 8.0;0.4 mol∕L NaCl)和80μL 10%SDS。渦旋振動后,加入2μL 20 mg∕mL蛋白激酶K,65℃條件下孵育1 h。渦旋后,加入20μL 10 mg∕mL Rnase酶,65℃下孵育10 min。加入300μL 5 mol∕L NaCl,渦旋30 s。10 000 r∕min下離心10 min,將上清液轉移至新的離心管中,加入等量異丙醇,渦旋后置于-20℃冰箱30 min,15 000 r∕min離心5 min后,移除上清液。向離心管中加入700μL體積分數為70%乙醇,吸打或者點振混勻,15 000 r∕min離心5 min后,移除上清液,重復該步驟。室溫開蓋干燥15—20 min至管內無液體殘留。向離心管中加入100μL滅菌水,劇烈振蕩。

(2)酚-氯仿提取法 稱取肉樣50 mg,加入液氮研磨成粉末,轉移至1.5 mL離心管中,加入500μL裂解液II(50 mmol∕L Tris-HCl,pH 8.0;10 mmol∕L EDTA,pH 8.0;0.1 mol∕L NaCl)、30μL 10%SDS和2μL 20 mg∕mL蛋白激酶K,50℃條件下孵育1 h。渦旋后,加入20μL 10 mg∕mL Rnase酶,50℃下孵育10 min。加入等體積的酚∕氯仿∕異戊醇(24∕24∕1,V∕V∕V)至反應體系中。渦旋3 min,10 000 r∕min下離心5 min。將上清液轉移至新的離心管,加入等體積氯仿∕異戊醇(24∕1,V∕V)。渦旋振蕩后,10 000 r∕min離心5 min。取上清液轉移至新的試管,加入等量冰浴過的乙醇,在10 000 r∕min離心5 min后,移除上清液。使用體積分數為70%乙醇溶液沖洗DNA,離心后去除上清液。殘渣用100μL滅菌水溶解。

(3)試劑盒法參照基因組提取試劑盒說明書進行提取。

1.3.2 引物設計

在GenBank中搜索牛、羊、雞、豬、鴨和驢等線粒體細胞色素b(Cyt b)的基因序列。釆用正反向引物特異的策略,通過Blast功能確保屬內序列間具有較高的同源性后,將序列導入到DNAMAN軟件中,分析屬間基因組的差異。在此基礎上,用Primer 6設計各物種的特異性引物。經過驗證與篩選,6種動物源性成分的引物信息見表1。

表1 牛、羊、雞、鴨、豬和驢等引物序列信息Table 1 The primer information of cattle,sheep,chicken,duck,pig and donkey

1.4 引物特異性驗證

利用設計及篩選的6對引物,分別擴增17種不同畜禽品種(牛、羊、雞、豬、鴨、驢、兔和狗)的基因組DNA,驗證引物的特異性;并分別擴增各動物組織的DNA,考察多重PCR反應體系的特異性與適用性。

1.5 多重PCR反應體系

PCR反應體系(50μL):5×PCR Buffer 10μL,dNTPMix濃度為0.2 mmol∕L,Taq DNA聚合酶2.5 U,MgCl23 mmol∕L,DNA模板1μL,最佳引物比例為牛∕羊∕雞∕豬∕鴨∕驢=2∕1∕1∕1∕0.5∕1[1代表10 pmol∕(50μL)],最后用滅菌水將體系補足至50μL。PCR反應條件為:94℃預變性5 min;94℃變性40 s,58.6℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個循環;72℃延伸5 min。反應結束后,取3μL PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,凝膠成像系統觀察結果并拍照。

1.6 多重PCR體系的優化

1.6.1 引物比例

設置5種引物比例[(1代表10 pmol∕(50μL)]:①牛∕羊∕雞∕鴨∕豬∕驢=1∕1∕1∕1∕1∕1;②牛∕羊∕雞∕鴨∕豬∕驢=2∕1∕1∕0.5∕1∕0.5;③牛∕羊∕雞∕鴨∕豬∕驢=2∕1∕2∕0.5∕2∕1;④牛∕羊∕雞∕鴨∕豬∕驢=2∕1∕1∕0.5∕1∕1;⑤牛∕羊∕雞∕鴨∕豬∕驢=2∕1∕2∕0.5∕1∕2。根據凝膠電泳條帶數量及亮度,確定最佳引物比例。

1.6.2 Mg2+濃度的優化

在多重PCR反應體系中,Mg2+的濃度依次設為1.0 mmol∕L、2.0 mmol∕L、3.0 mmol∕L、4.0 mmol∕L、5.0 mmol∕L,根據凝膠電泳條帶數量及亮度,確定體系中最優的Mg2+濃度。

1.6.3 退火溫度的優化

利用梯度PCR反應程序,分別設定退火溫度為53.0℃、53.9℃、55.0℃、57.4℃、58.6℃、59.8℃、61.0℃和62.0℃,其他反應條件不變。根據凝膠電泳條帶數量及亮度,確定最佳退火溫度。

1.7 檢測靈敏度

將100 ng∕μL的6種動物源性成分的DNA模板混合稀釋至10 ng∕μL,然后用滅菌蒸餾水依次稀釋至1 ng∕μL、0.1 ng∕μL、0.01 ng∕μL、0.001 ng∕μL。利用1.5中多重PCR方法進行擴增,考察多重PCR方法的靈敏度。

1.8 市售樣品檢測

采集15份市售的肉類產品,包括5份肉丸、5份火腿及5份鮮肉卷等,利用建立的六重PCR方法進行檢測。同時,使用現行頒布的標準方法:《SN∕T 3731.5—2013食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法第5部分:鴨成分檢測PCR法》《SN∕T 2051—2008食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測方法實時PCR法》《SN∕T 2978—2011動物源性產品中雞源性成分PCR檢測方法》《SN∕T 3730.4—2013食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法第4部分:驢成分檢測實時熒光PCR法》與本方法進行對比確證。

2 結果與分析

2.1 肉類DNA提取方法

如表2所示,對于羊、雞、豬、鴨和驢等源性成分,試劑盒法提取的DNA濃度最高,酚-氯仿法與鹽抽提法次之;對于牛源性成分,3種提取方法的DNA得率基本一致。鹽抽提法提取的DNA A260∕A280值在1.57—1.82,酚-氯仿抽提法的DNA A260∕A280值在1.78—1.91,試劑盒提取法的DNA A260∕A280值在1.98—2.06。相比較而言,試劑盒法提取的DNA純度更高。

表2 不同抽提方法對DNA濃度及純度的影響Table 2 Effects of different extraction methods on DNA concentration and purity

2.2 引物特異性驗證

如圖1(a)所示,使用牛引物分別擴增17種動物組織的DNA。結果顯示:南陽牛、魯西黃牛及和牛均出現493 bp擴增條帶,而安多牛和其他肉制品未出現特異性條帶。如圖1(b)—(f)所示,分別使用羊、雞、豬、鴨和驢的引物擴增17種動物組織。結果顯示:羊、雞、豬、鴨和驢的擴增條帶分別為302 bp、400 bp、265 bp、239 bp和123 bp,其他種屬動物DNA擴增結果均為陰性。表明所選擇的6對引物對同種屬動物源性成分能擴增出目的條帶,對其他肉源性成分均無擴增現象,引物特異性良好。

圖1 單引物分別擴增各動物DNA的電泳圖Fig.1 The gel electrophorogram of DNA from different animal species by signal prime

同時,考察了單引物分別擴增含6種動物源性成分的混合DNA模板。如圖2所示,每對引物僅擴增出單一特征性的目的條帶。使用六重引物體系分別擴增牛、羊、雞、豬、鴨和驢等動物源性成分,也均擴增出單一特征性條帶,表明所設計的引物可滿足多重PCR的特異性要求。

圖2 單重PCR和六重PCR反應體系的凝膠電泳Fig.2 The gel electrophorogram of single and multiple PCR system

2.3 多重PCR反應條件的優化

2.3.1 不同引物比例對多重PCR反應的影響

引物濃度可影響PCR擴增效率[19]。若引物濃度過低,則引物不能充分與DNA靶標位點結合,從而導致產物量降低;若引物濃度過高,則容易引起錯配,導致非特異性產物增加。在多重PCR反應體系中,引物之間也可能會產生交叉結合,從而影響PCR反應的效率。如圖3所示,當牛∕羊∕雞∕鴨∕豬∕驢=2∕1∕1∕0.5∕1∕1時,各物種間無交叉反應,可出現6條清晰的目的條帶。

圖3 不同引物比例對PCR擴增效率的影響Fig.3 Effects of different primer ratios on the PCR amplification efficiency

2.3.2 Mg2+濃度對多重PCR反應的影響

Mg2+是TaqDNA聚合酶的活性因子,其濃度對PCR擴增的特異性和產量均有影響。當其濃度過低時,會降低TaqDNA聚合酶的活性,使擴增產物量減少;當濃度過高時,可導致酶催化的非特異性擴增增加。如圖4所示,當Mg2+濃度為1 mmol∕L時,豬、鴨和驢的目的條帶亮度十分低;當Mg2+濃度增加至2—3 mmol∕L時,可擴增出6條目的條帶;當Mg2+濃度高于3 mmol∕L時,驢的目的條帶亮度較低。最終選擇Mg2+濃度為3 mmol∕L。

圖4 Mg2+濃度對PCR擴增效率的影響Fig.4 Effects of Mg2+concentration on PCR amplification efficiency

2.3.3 退火溫度對多重PCR反應的影響

退火溫度是引物與DNA模板結合的溫度,也是影響PCR反應特異性的重要因素[20]。在PCR反應中,退火溫度過低會增加非特異性擴增,退火溫度過高則擴增不出目的條帶。如圖5所示,當退火溫度小于55℃時,無法擴增出豬源性成分的目的條帶,僅能擴增出另外5種源性成分的目的條帶;當溫度提高至55℃時,可同時擴增出6種源性成分的目的條帶。通過比較,本研究選擇58.6℃為最佳退火溫度。

圖5 退火溫度對PCR擴增效率的影響Fig.5 Effects of annealing temperature on PCR amplification efficiency

2.4 檢測靈敏度試驗

如圖6所示,當添加1μL 0.1 ng∕μL混合DNA時,仍可擴增出6種動物源性成分的目的條帶,表明該方法檢測6種動物源性成分的靈敏度為0.1 ng∕μL DNA。

圖6 六重PCR方法的靈敏度Fig.6 The sensitivity of multiple PCR method

2.5 市售樣本分析

利用建立的六重PCR方法與現行頒布的行業標準對市售肉制品進行檢測。如表3所示,5份肉丸中有2份檢出標注成分之外的肉類,例如牛肉丸中檢出鴨和豬源性成分等;5份火腿樣品中有3份檢出標注成分之外的肉類;5份鮮肉卷均為其標注的肉類成分。總體來看,對于肉丸與香腸制品仍需加強市場監管與抽查力度。

表3 15份市售肉制品分析結果Table3 Analysis results of 15 of meat products from market

3 討論

肉制品摻假是食品質量安全領域一直存在的問題。我國監管部門針對肉源成分的鑒定已頒布了約31個國家、行業或地方標準。然而,這些標準大多數僅能同時檢測2—3種動物源性成分,尚未頒布可同時檢測4種以上肉制品的技術標準。另外,國內外已有不少研究人員建立了基于PCR的動物源性成分鑒定方法。唐修君等[21]以線粒體16SrRNA基因序列為靶位點設計特異性引物,建立了可檢測羊、牛、豬、兔和雞源性成分的檢測方法。該方法在同一反應體系中僅能檢測單種動物源性成分,不能同時檢測多種源性成分。本研究建立了一種可同時鑒別食品中牛、羊、雞、豬、鴨、驢等源性成分的多重PCR方法。該方法可在一個PCR反應體系中同時鑒定6種動物源性成分,極大地節省人力、時間和檢測成本。馮海永等[22]建立了檢測羊肉產品中7種動物源性成分的PCR方法,該方法引物的設計采用上游引物共用、下游引物特異的策略,未針對不同動物源性成分設計各自特異性的引物對,也未考察反應體系同時擴增7種肉源成分的效果。同樣,Song等[23]建立了可同時檢測牛、羊和豬源性成分的檢測方法。該方法也采用上游引物共用、下游引物特異的引物選擇策略。本研究起初針對不同畜禽種類自行設計合成了6對特異性的引物,并在17種不同品種或品系的肉制品中進行驗證,結果表明牛、羊、雞引物僅對本類肉制品擴增出目的條帶,引物特異性高;豬、鴨和驢引物對其他肉類也可擴增出目的條帶,引物特異性較差。鑒于此,本研究篩選并驗證了已報道的豬、鴨和驢引物,并結合自行設計的牛、羊、雞引物,建立了六重PCR檢測方法。

多重PCR技術可極大節約檢測成本和簡化操作步驟,但是多重PCR技術也存在一定的技術難題。例如,在同一反應體系中加入多對特異性引物,極有可能會出現非特異性擴增,產生拖尾和引物二聚體,從而造成目標序列擴增效率下降及靈敏度降低等情況,進而使相關方法的推廣及標準化受到限制[24]。一般來講,影響擴增效果的因素包括:引物濃度、Mg2+濃度、退火溫度、模板濃度、循環參數等[25]。本研究通過對引物比例、Mg2+濃度、退火溫度進行優化,提高引物反應過程中的特異性和靈敏度,最終擴增出6條特異性目的條帶,不同物種間無交叉反應,極大地節約了檢測成本、提高了檢測效率。

總體來說,本研究建立了一種可同時檢測肉制品中牛、羊、雞、豬、鴨和驢等源性成分的多重PCR方法。相較于已報道的方法,本研究自行設計了牛、羊和雞等源性成分的高特異性引物,并且在17種不同品種的畜禽產品中進行驗證,確保了所使用的引物在不同品種間依然有較強的特異性,避免出現假陽性結果。另外,相較于熒光定量PCR方法,該方法具有檢測成本低、操作簡單快捷等優點,可在基層監管部門中推廣應用,為維護消費者權益,打擊肉制品摻假售假等問題提供技術支撐。