GLIS1基因多態性與綿羊產羔數之間的關系研究

周 梅,劉秋月,狄 冉,胡文萍,王翔宇,張效生,張金龍,儲明星?

(1中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所,農業農村部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室,北京100193;2安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所,豬分子數量遺傳學安徽省農業科學院重點實驗室,畜禽產品安全工程安徽省重點實驗室,合肥230001;3天津市畜牧獸醫研究所,天津300381)

產羔數是綿羊最重要的經濟性狀之一,據報道,它對綿羊繁殖力遺傳進展的經濟效益貢獻率為74%—96%,因此,尋找與產羔數相關的主效基因一直是遺傳育種研究者關注的重點[1-3]。

GLIS1來源于轉錄因子中最大的家族Kruppel樣鋅指蛋白,是一種在小鼠卵母細胞和受精卵一、二細胞期高表達的蛋白,在小鼠胚胎發育中的表達具有時空性[4]。GLIS1同時具有轉錄激活和轉錄抑制活性,能夠對胚胎發育的特定階段進行調控,對于小鼠的胚胎發育尤為重要,同時Gli蛋白的表達或活性又受其上下游BMP和Wnt蛋白家族的成員調控[5]。Takahashi等[6]報道,在體外培養條件下GLIS1基因在卵母細胞以及胚胎發育不同階段的細胞中表達,且在牛胚胎發育過程中十分關鍵。王小海等[7]研究發現,GLIS1基因在小鼠的胚胎發育以及成纖維細胞的重編程過程中均發揮重要作用。胚胎發育成功與否對動物的的生殖力會產生直接影響,因此對影響胚胎發育過程的重要因子進行研究很有必要。

前期,本實驗室對中國9個地方綿羊品種(分為單羔組和多羔組)共89只綿羊開展了全基因組重測序[8],篩選到綿羊產羔數候選基因GLIS1及相關多態位點。鑒于GLIS1在哺乳動物生殖中的作用還未見報道,本研究對該基因兩個單核苷酸多態位點g.27775611 T＞C和g.27857114 T＞G在不同綿羊群體中的多態性進行檢測,并與小尾寒羊產羔數進行關聯分析,以探討GLIS1基因與綿羊產羔數之間是否存在某種內在聯系,以期為綿羊高效育種提供充分的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

實驗動物共包含760只綿羊,具體信息如表1所示。

表1 綿羊樣本具體信息Table 1 Specific information of sheep sample

1.2 SNP位點檢測

由北京君諾德生物技術有限公司采用Sequenom MassARRAY?SNP技術[9]對GLIS1基因兩個多態性位點g.27775611 T＞C和g.27857114 T＞G在不同產羔數的綿羊品種中進行基因型檢測。分型樣品為DNA(樣本量20μL,樣品質量濃度為40—80 ng∕μL)。

1.3 數據分析

利用SPSS20統計軟件對GLIS1兩個SNP位點多態性與小尾寒羊各胎次產羔數分別進行差異顯著性分析,采用比較均值和一般線性模型單因素方差分析中的最小顯著差異(Least significant difference,LSD)法進行分析。使用的相關性分析模型與寸靜宇[10]和文禹粱[11]論文中報道的一致。

2 結果與分析

2.1 GLIS1基因多態性分析

通過分型發現,GLIS1基因2個SNP位點在分型的綿羊品種中共存在3種基因型,g.27775611 T＞C位點3種基因型分別是TT、CT和CC,g.27857114 T＞G位點分別是TT、GT和GG(圖1)。

圖1 GLIS1基因分型Fig.1 Genotyping of GLIS1 gene

根據分型結果,對2個SNP位點在單、多羔品種中的基因型頻率和等位基因頻率進行統計,并用卡方檢驗的方法驗證單、多羔綿羊品種間的基因型頻率和等位基因頻率之間的差異。

由表2可知,在不同產羔能力的2個綿羊品種之間,GLIS1基因2個SNP位點的等位基因和基因型頻率均達到極顯著水平(P＜0.01)。g.27775611 T＞C和g.27857114 T＞G位點在兩個綿羊品種中的優勢等位基因分別為T和G。

表2 GLIS1基因SNP位點在2個綿羊品種中等位基因和基因型頻率分析Table 2 Analysis of allele and genotype frequencies of SNPs at GLIS1 gene in two sheep breeds

對2個SNP位點在6個綿羊品種中的基因型頻率和等位基因頻率分別進行統計,并計算該位點在各群體中的多肽信息含量(反映某個等位基因在群體中受選擇的強度,其值大小與受選擇強度成正比)、雜合度和有效等位基因數,并用卡方檢驗該位點在各群體中的平衡狀態。從表3可知,GLIS1基因g.27775611 T＞C位點在灘羊、薩福克羊和草原型藏羊這三個群體中呈中度多態(0.25≤PIC＜0.5),在小尾寒羊、蘇尼特羊和杜泊羊3個群體中均呈低度多態(PIC＜0.25);g.27857114 T＞G位點在薩福克羊和杜泊羊2個群體中呈中度多態(0.25≤PIC＜0.5),在小尾寒羊、灘羊、蘇尼特羊和草原型藏羊4個群體中均為低度多態(PIC＜0.25)。χ2檢驗結果表明,除了杜泊羊的g.27775611 T＞C位點以及草原型藏羊的g.27857114 T＞G位點外,其余位點在各品種中均處于哈代溫伯格平衡狀態(P＞0.05)。

表3 GLIS1基因SNP位點的群體遺傳學分析Table 3 Population genetic analysis of SNPs at GLIS1 gene

2.2 GLIS1基因多態位點與小尾寒羊產羔數的關系

將2個SNP位點分別與小尾寒羊3個胎次的產羔數進行關聯分析,結果見表4。GLIS1基因g.27775611 T＞C位點突變顯著影響小尾寒羊第二胎產羔數(P＜0.05),但對第一胎和第三胎產羔數無明顯影響(P＞0.05),但總體而言,CC型產羔數最多,TT型其次,CT型最少;g.27857114 T＞G位點與各胎產羔數之間均無顯著關聯(P＞0.05)。

表4 GLIS1基因2個SNP位點與小尾寒羊產羔數關聯分析Table 4 Analysis between the two SNP loci of GLIS1 gene and litter size in Small Tail Han Sheep

3 討論與結論

綿羊在我國家畜中占據重要地位,是三大家畜之一,但絕大多數綿羊產羔數低的特點成為我國綿羊產業發展的主要限制因素[12]。因此,如何適當提高綿羊每胎的產羔數是養羊業亟待解決的科學難題。隨著現代分子生物技術的迅速發展,高產羔數主效基因分子標記在綿羊生產中的應用可能是解決其產羔數低的有效方法。目前科學家已經定位了一些與綿羊產羔數相關的主效基因,其中最為著名的是BMPR1B[13-15]、BMP15[16-17]、GDF9[18-19]和B4GALNT2[20]。然而綿羊的產羔數性狀是一個受微效多基因調控的復雜性狀,僅僅靠已經發現的高產羔數主效基因分子標記很難在整體上提高綿羊的產羔數,繼續挖掘與產羔數相關的基因仍十分必要。本實驗室前期通過全基因組重測序發現GLIS1基因在單、多羔綿羊之間FST值達到了顯著水平,雖然目前尚無GLIS1基因與動物繁殖性能之間關系的相關報道,但已有其在小鼠胚胎發育中的相關報道[5],而胚胎發育也是影響動物最終生殖力的重要階段。因此,本研究首次對候選基因GLIS1多態性與綿羊產羔數之間的關系進行研究,旨在探討其多態性與綿羊產羔數之間的關系,從而尋找與綿羊產羔數相關的候選基因及關鍵位點。

通過對GLIS1基因2個SNP位點g.27775611 T＞C和g.27857114 T＞G進行分型分析發現,在不同產羔能力的兩個綿羊品種之間,GLIS1基因2個SNP位點的等位基因和基因型頻率均達到極顯著水平(P＜0.01),表明這2個SNP位點很可能與綿羊的產羔數有關。群體遺傳學分析表明,g.27775611 T＞C位點在灘羊、薩福克羊和草原型藏羊中受到中等強度選擇(0.25≤PIC＜0.5),g.27857114 T＞G位點在薩福克羊和杜泊羊中受到中等強度選擇,2個位點在其他綿羊品種中受到選擇的強度很低(PIC＜0.25),該結果表明不同位點在不同的綿羊品種中會受到不同強度的選擇,不過以上結果可能與某個綿羊品種遺傳多樣性較低有關,另外,本試驗中有的品種樣本量較少可能也對結果有一定程度的影響。哈代溫伯格平衡分析結果表明,在長期的進化和選擇下,兩個位點在遺傳適應性上可能具備一定的優勢。杜泊羊的g.27775611 T＞C位點和草原型藏羊的g.27857114 T＞G位點均沒有任何突變型,小尾寒羊和灘羊的g.27857114 T＞G位點存在少數突變雜合個體,但均無突變純合個體,可能是因為純合突變型個體在胚胎發育過程中就死亡了,而突變雜合型的生存力可能相比野生型也削弱了很多,因此存在的個體很少。關聯分析結果顯示,GLIS1基因的g.27775611 T＞C位點突變純合子在各胎次中產羔數最高,突變雜合子在各胎次中產羔數最低且低于突變純合子,且在第二胎中達到了差異顯著水平,但由于突變純合子在所選群體中個體較少,不具有很強的說服力,有待于增加樣本量進一步研究。g.27857114 T＞G位點沒有野生型個體且突變雜合型個體很少,說明該位點突變純合增加了個體的適應性,但該位點突變是否增加了產羔數,因沒有野生純合個體所以無法得知。突變純合子在第二胎和第三胎中產羔數均最高,但與突變雜合子之間未達到差異顯著水平,初步推測g.27857114 T＞G位點雖然對綿羊產羔數有一定影響,但可能并不是影響綿羊產羔數的關鍵位點。

本研究初步得出以下結論:GLIS1基因錯義突變位點g.27775611 T＞C(蘇氨酸→丙氨酸)與小尾寒羊產羔數顯著相關,可能參與綿羊生殖調控;而錯義突變位點g.27857114 T＞G(蘇氨酸→脯氨酸)與綿羊產羔數無顯著關聯。