上海地區四種草莓病毒的檢測分析

劉 雅,楊 靜,張麗勍,李 斌,周艷孔,周 潔,高清華?,段 可

(1上海市農業科學院林木果樹研究所,上海201403;2上海海洋大學食品學院,上海201306;3上海市金山區農業技術推廣中心,上海201500;4上海市浦東新區農業技術推廣中心,上海201201;5上海市奉賢區農業技術推廣中心,上海201400)

草莓果實色澤艷麗、柔軟多汁、口感鮮美、芳香宜人,市場供應持續時間長,種植效益高,已成為我國乃至世界各地廣泛栽培的重要特色園藝作物。截至2018年,我國草莓栽培面積達17.33萬hm2,總產量達500萬t,其中冷涼地區四季種植草莓面積達5 000 hm2,共選育品種112個[1]。草莓在上海地區進行規模化種植已經有30年以上,草莓果實應季上市時節適逢我國幾個大的傳統節日,深受廣大市民喜愛,經濟、生態效益俱佳,在上海郊區尤其是青浦、崇明、浦東、奉賢、金山、嘉定等區均有規模化種植。但目前上海郊區草莓生產中主栽品種是‘紅顏’和‘章姬’,經過多年種植,出現抗病毒和抗病蟲能力差、育苗難、品質下降等一系列問題,而其中草莓病毒病更是嚴重地影響了草莓產業的可持續健康發展。

世界上已報道的草莓病毒有25種以上,主要通過蚜蟲、粉虱、線蟲、卵菌等傳播。其中,由蚜蟲傳播的草莓病毒病對草莓危害最為普遍[2-4],常見的有草莓輕型黃邊病毒(SMYEV)、草莓斑駁病毒(SMoV)、草莓鑲脈病毒(SVBV)和草莓皺縮病毒(SCV)等。草莓植株一旦感染病毒多是代代相傳且具有潛隱性,只有多種病毒復合侵染時植株葉片才表現花葉、皺縮、褪綠黃化以及植株矮化等典型癥狀[5-6],造成生長結果能力下降;受單一病毒感染的草莓植株通常無癥狀,但產量和品質受到嚴重影響。據報道,與健康植株相比,‘Camarosa’草莓植株受SMYEV感染后無癥狀的植株,其單株總果實數、商品果實數和單果重均顯著減少,下降達28%—63%;而且病毒復合感染植株的產量損失更大,與健康植株相比可減少78%—99%[7]。因此,在上海地區加快草莓脫毒種苗繁育及其應用推廣是當前草莓產業持續健康發展的迫切需要。

目前,對于上海地區草莓病毒病的種類和發生為害產區分布情況缺乏長期性、系統性跟蹤研究,本試驗選取在我國南方地區為害嚴重的4種草莓病毒(SMoV、SMYEV、SVBV和SCV)作為檢測對象,采用RTPCR分子檢測技術測定這4種草莓病毒在上海郊區的發生情況,以期為草莓病毒病的有效防控提供指導,進一步為草莓脫毒種苗繁育及其應用推廣提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

2019年3—8月于上海市金山區(46份)、奉賢區(37份)、浦東新區(65份)共采集到137份疑似病毒癥狀病樣或病毒病典型癥狀材料,-70℃冰箱保存備用。

1.2 主要試劑與測定儀器

OMEGA植物RNA提取試劑盒(R6827-01)購自鄭州威展生物科技有限公司;反轉錄試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司;Taq DNA聚合酶購自上海博彩生物科技有限公司。

所用儀器包括ETC-811 PCR儀(東勝國際貿易有限公司)、Bio-Rad Powerpac電泳儀(伯樂生命醫學產品(上海)有限公司)和Tanon 3500凝膠成像系統(上海天能科技有限公司)。

1.3 方法

根據相關文獻設計引物[8-9],委托生工生物工程(上海)有限責任公司合成(表1)。

表1 4對草莓病毒特定引物序列Table 1 Specific primers sequences of four strawberry viruses

1.3.1 草莓總RNA提取和cDNA合成

按照RNA提取試劑盒說明書提取樣品總RNA,利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性,使用Thermo Scientific Nanodrop2000微量紫外分光光度計進行純度和含量測定。使用HiScript III 1 st Strand cDNA Synthesis Kit進行cDNA的合成,操作按照試劑盒說明書進行。

1.3.2 病毒RT-PCR檢測

以上述cDNA為模板,利用SVBV,SMoV、SMYEV和SCV 4種病毒引物進行RT-PCR檢測,RT-PCR程序:94℃預變性5 min;94℃變性30 s,55℃退火45 s,72℃延伸45 s,30個循環;72℃延伸5 min。陽性對照為攜帶病毒特異片段的質粒(pUC19為載體骨架)DNA,陰性對照為純水。取5μL PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳,在凝膠成像系統中觀察電泳結束后的DNA片段。PCR產物純化后,連同特異引物送往上海生工生物工程有限責任公司測序,所得序列用DNAMAN軟件與GenBank中對應病毒基因組序列進行多重序列比對分析。

2 結果與分析

2.1 上海部分地區4種草莓病毒病的檢測與分布

在上海市金山、奉賢和浦東3個地區均檢測出含有SVBV和SMoV兩種病毒,但未檢測到SCV(圖1)。其中,SVBV在金山區采集病樣中檢出率最高達到58.7%;SMoV在金山區和奉賢區采集病樣中均有較高檢出率,均在60%以上;但是,SMYEV病毒僅在浦東新區采集樣品中檢測到,檢出率為1.5%。綜合統計分析來看,病毒總檢出率達到64.2%。在所檢測4種草莓病毒中,以SMoV總檢出率最高,達到43.8%。如表2所示,病毒總檢出率較高的采集地是金山區和奉賢區,均在80%以上。4種病毒在各樣品采集地區的分布規律性不明顯,但不同地區采集樣品的檢出率差異明顯(表2)。

圖1 部分草莓樣品中4種病毒感染情況的RT-PCR檢測結果Fig.1 RT-PCR results of four viruses in some strawberry samples

表2 不同地區各病原病毒檢出率Table 2 Detection rates of various pathogenic viruses in different regions

2.2 檢測病毒陽性樣品測序分析

利用4種病毒的特異性引物對上海市金山、奉賢、浦東的137份樣品進行RT-PCR檢測,SVBV、SMoV和SMYEV均擴增得到單一且清晰條帶。其中SMYEV僅檢出1個陽性樣品,測序后與數據庫(No.D12517)比對,相似度為100%。對SVBV和SMoV檢出的多個陽性樣品,隨機抽取10個擴增產物符合預期大小的PCR產物純化后測序,與數據庫中對應病毒序列進行比較,樣品測序結果均顯示存在多個SNP(圖2)。

圖2 檢出草莓陽性病毒序列比對分析Fig.2 Alignment analysis of strawberry positive virus detected

SVBV所選陽性樣品中都存在11個位點的突變,所有樣品在SVBV基因組序列(NC.001 725.1)2 426 bp和2 512 bp處發生了AT突變,在2 444 bp和2 494 bp處發生了CT突變,在2 446 bp、2 495 bp、2 497 bp、2 500 bp以及2 530 bp處分別發生了AG、TC、GT、GA以及TG突變;樣品1-13在2 421—2 422 bp處由CC突變為TT,因此,SVBV病毒在上海地區至少存在2種不同的SVBV病毒小種(圖2)。

SMoV所選陽性樣品中,有4個樣品(1-24、3-7、3-11和3-9)存在10個位點的突變,在SMoV基因組序列(AJ.311 875.1)6 285 bp、6 290 bp、6 293 bp、6 295 bp以及6 297 bp處分別發生了AT、TC、TA、CT以及GA突變;樣品1-24、3-7和3-11在6 261—6 262 bp處發生了堿基置換(AT-TA),在6 304—6 305 bp處由TT突變為AC;樣品3-9在6 262 bp和6 304 bp處均發生了TA突變,在6 305 bp處缺失了堿基T,因此,在上海地區至少有3種不同的SMoV病毒小種(圖2)。

2.3 上海地區4種草莓病毒病的分子檢測與表現癥狀綜合分析

田間采集的137份樣品中,除了帶有疑似病毒典型癥狀如皺縮、斑駁、失綠等,還包括疑似病害感染癥狀如葉片萎蔫、褐變或根深紅等。單一SVBV或SMoV感染材料多不具有典型病毒感染癥狀;SMov和SVBV復合感染率為21.2%,植株表現為生長勢弱,葉片表現不一,如斑駁、皺縮、失綠、葉脈褪綠、大小葉等(圖3)。

圖3 部分樣品病毒單一感染以及復合感染癥狀Fig.3 Symptoms of strawberry infected with single virus or multiple viruses

3 結論與討論

本研究選取上海3個地區共137份樣品中4種常見蚜蟲傳播病毒SVBV、SMoV、SMYEV以及SCV,采用RT-PCR分子檢測技術測定其在上海郊區的發生情況,結果顯示,感染SVBV和SMoV較為普遍,而SMYEV病毒僅在1份樣品中檢到,SCV未檢測到,說明后兩種病毒在上海地區比較少見或者不存在。

除單一病毒感染外,還有部分樣品受到復合感染,主要為SMoV和SVBV復合感染,可使草莓出現皺縮、斑駁、失綠等明顯癥狀。對比福建地區[10]和新疆地區[11]SMoV的檢測結果(分別為19.3%和23.78%),SMoV在上海地區的檢出率明顯較高,達到43.8%。本研究采樣中SVBV與SMoV的復合感染率也較高,達到21.2%,福建地區和新疆地區分別為12.9%和10.89%[10-11]。由此可見,這些常見病毒在我國普遍存在。另外,本研究采樣地上海金山、奉賢、浦東所有采集樣品中均未檢測出SCV,推測SCV在各地發生率低,或者是病毒變異導致先前的檢測引物不適用、待更新。

上海多數草莓種植戶仍采用自繁自育的傳統模式,多年連續栽培而從未采用脫毒種苗,導致草莓種苗質量下降。另外,草莓種植戶多憑經驗而很少按照草莓標準化栽培技術種植,不科學不規范的栽培管理措施加大了草莓感染病毒病的幾率,嚴重影響了草莓的產量和品質,導致草莓畸形果增多,病蟲害嚴重等[12]。因此,有效的草莓病毒病防控措施對草莓產業的發展有著重要的意義。目前,上海市大力推動草莓脫毒苗技術研發,先后在草莓主產區包括青浦、浦東、奉賢建立脫毒苗原種圃、生產苗育苗基地,向全市及周邊地區提供優質種苗[13]。

田間雜草常常是草莓病毒的中間寄主,作為病毒傳播媒介的昆蟲通過田間雜草將病毒轉移到草莓植株上,感染后進而造成其產量損失[14]。本研究中有35.8%的樣品未檢測出病毒感染,但卻表現有葉片腐爛,枯死,萎蔫,葉片邊緣焦黃,皺縮,葉片褐色等癥狀。可見,除了感染炭疽菌等病原菌外,還有可能是土壤肥力過大,發生肥害而導致葉片皺縮干枯,葉片發黃甚至枯死[15];另外,有些葉片邊緣焦黃干枯的癥狀有可能是缺素導致的。因此,及時拔除病株、摘除病葉并進行銷毀,增施有機肥料、合理施用化肥等對促進草莓健壯生長,提高抗病毒能力均有一定的效果[16]。

隨著核酸測序技術和檢測技術的發展,越來越多的草莓病毒被發現。最近報道了一種新型蚜蟲傳播草莓細胞質彈狀病毒,暫命名為“草莓病毒1”(StrV-1),其感染癥狀為葉片不規則的褪綠以及花萼葉的增殖[17]。在栽培草莓中發現另一種新型病毒,暫命名為“草莓相關病毒1”(SaV1),并測定了其全基因組序列,SaV1N和L基因與9個已報道的細胞質彈狀病毒的氨基酸序列同源性分別為32%—57%和38%—64%,歸類為細胞質彈狀病毒屬[18]。近年來,草莓環狀病毒3(SCrV-3),草莓環狀病毒4(SCrV-4),草莓白化病毒(SPaV)等在我國也相繼被報道[19-20]。另外,草莓病毒中還有一些少見的食源性病毒如諾如病毒,這類病毒很容易通過食物能進入人體中,對人體健康造成威脅,甚至在人群中造成流行性疾病[21-22]。因此,草莓病毒病的防治對草莓產業的發展以及人類健康都有著重要的意義。隨著越來越多新病毒被發現,在栽培過程中病毒在植株體內不斷積累,加之草莓病毒具有侵染途徑多樣、侵染方式復雜等特征,病毒防控工作也變得更加重要,新病毒一旦傳播開來,會對生產造成巨大的損失。因此,今后需要進一步優化病毒檢測方法、擴展檢測對象,這對草莓病毒病的防控以及草莓產業的發展有著十分重要的意義。