上海地區小麥赤霉病菌群體分析

張建周,郜 振,吳楠楠,楊憲立,張靜雅,宮安東,王建華??

(1河南省農業科學院小麥研究所,鄭州450002;2信陽師范學院,信陽464000;3上海市農業科學院農產品質量標準與檢測技術研究所,上海201403)

禾谷鐮刀菌復合群(Fusarium graminearumspecies complex,FGSC)引起的小麥赤霉病(Fusarium head blight)是小麥的重要真菌病害,嚴重影響小麥生產[1],我國的長江流域、黃淮流域等重要冬麥區是小麥赤霉病的常發區,受害尤為嚴重[1-2]。統計表明:2000—2018年,我國小麥赤霉病每年發生面積均超過450萬hm2,約占當年全國小麥種植面積的20%—25%,每年造成的產量損失超過341萬t,累計造成直接經濟損失超100億元人民幣[3-4]。值得注意的是,2010年以來,我國小麥赤霉病常發區域持續呈重發態勢,流行頻率顯著高于20世紀[5]。國際玉米小麥改良中心(CIMMYT)已將赤霉病列為影響全球谷物生產的主要因素之一[6]。

FGSC產生的多種真菌毒素是影響糧食生產和食品安全的重大隱患[4]。單端孢霉烯毒素(Trichothecenes)是最常見的鐮刀菌毒素,包括A、B、C、D四類,其中以B類污染最為嚴重。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)及其乙酰化衍生物(3-Acetyldeoxynivalenol,3-ADON和15-Acetyldeoxynivalenol,15-ADON)、雪腐鐮刀菌烯醇(Nivalenol,NIV)及其乙酰化衍生物(4-Acetylnivalenol,4-ANIV)都是較為常見的B類單端孢霉烯毒素[3-4]。這些毒素化學結構非常相似,具有相同的骨架結構,主要區別在于側鏈基團的修飾不同(圖1)。另外,單端孢霉烯毒素性質非常穩定,常規的高溫高壓處理無法使之降解,很容易隨食品、飼料加工過程進入食物鏈,嚴重威脅人畜健康。在中國,危害流行的FGSC主要是亞洲鐮刀菌(Fusarium asiaticum)和禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearumsensu stricto)兩個種群,其中F.asiaticum主要分布在較溫暖的長江流域及以南地區,F.graminearumsensu stricto則主要分布在年平均氣溫較低的黃河流域及以北地區。Zhang等[7]研究表明,長江中下游麥區的F.asiaticum以3-ADON型為主,而F.graminearumsensu stricto群體以15-ADON型為主。

圖1 常見的B類單端孢霉烯毒素結構式Fig.1 Chemical structures of type B trichothecenes

長三角地區是我國小麥赤霉病發生程度最為嚴重、暴發頻率最高的地區。一直以來,江蘇和安徽小麥赤霉病不僅發病面積大,毒素污染也最嚴重。有調查表明,其重病田塊中小麥DON毒素濃度是國家限量標準的40多倍(41 157μg∕kg)[8]。2010—2015年,江蘇省21個市、縣1 530份小麥樣品DON毒素的檢出率高達89.1%[4]。全國農技中心發布的農作物重大病蟲害發生趨勢預報顯示,我國2020年小麥赤霉病偏重流行風險高[9]。其中,長江中下游和江淮麥區預計大流行,黃淮南部麥區偏重流行,其他麥區流行風險較低[9]。因此,開展長三角地區相關的病害流行學調查,如菌群結構分布、菌株產毒化學型分析、病原菌適應性、抗藥性等研究,對小麥赤霉病及鐮刀菌毒素污染防控及治理具有重要意義。本研究于2019年從上海地區采集小麥赤霉病樣本,對病原菌進行分離鑒定和產毒基因型研究,旨在明確上海地區引起小麥赤霉病的FGSC的種群結構及潛在的毒素污染風險,為有針對性地開展病害防控及農產品安全監測提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

霉菌培養箱(MJP-250F-1)、高壓滅菌鍋(SX-500,Tomy,日本)、超凈工作臺、Milli-Q純水系統(Millipore,美國)、Tissuelyser II高通量組織研磨儀(Qiagen,德國)。

PDA培養基:馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂粉15 g。

2×CTAB溶液:質量分數為2%CTAB溶液,100 mmol∕L Tris-HCl(pH 8.0)溶液,20 mmol∕L EDTA(pH 8.0)溶液,1.4 mol∕L NaCl溶液。

1.2 試驗方法

1.2.1 小麥赤霉病菌分離純化

2019年,從上海市奉賢區、金山區、浦東新區、青浦區和嘉定區的冬小麥田中采集感染小麥赤霉病的病穗,通過組織分離法進行病原菌分離和純化,利用單孢分離技術獲得單孢菌株[10],經初步形態學鑒定,共獲得FGSC菌株65株。將菌株接種至含有PDA培養基的2 mL離心管中,待菌絲長滿后置于4℃保存。

1.2.2 DNA提取

分離的單孢菌株在PDA平板培養3—5 d后,用無菌牙簽收集菌絲至含有沙子和CTAB緩沖液的離心管中,組織研磨儀破碎菌絲體后提取基因組DNA[11]。利用NanoDrop 2000測定所提取的DNA濃度后,-20℃冷凍保存備用。

1.2.3 菌株鑒定

利用引物Fg16F(5’-CTCCGGATATGTTGCGTCAA-3’)和Fg16R(5’-GGTAGGTATCCGACATGGCAA-3’)對菌株的SCAR類型進行鑒定[12]。PCR反應體系為20μL,擴增程序參照Carter等[12]的方法。擴增結束后,取2μL產物用1.2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.2.4 菌株TEF基因測序分析

利用引物EF-1[5’-ATGGGTAAGGA(A∕G)GACAAGAC-3’]和EF-2[5’-GGA(G∕A)GTACCAGT(G∕C)ATCATGTT-3’]對部分代表性菌株TEF基因(Translation elongation factor 1-α)進行擴增[13],PCR擴增所用的酶為高保真DNA聚合酶。PCR反應體系為50μL,反應程序參照O’Donnell等[13]的方法。擴增結束后,取2μL產物進行瓊脂糖凝膠電泳,擴增產物條帶單一且較亮的樣品送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.2.5 菌株化學型分析

利用引物Tri13P1[5’-CTC(C∕G)ACCGCATCGAAGA(C∕G)TCTC-3’]和Tri13P2[5’-GAA(C∕G)GTCGCA(A∕G)GACCTTGTTTC-3’]對菌株產毒化學型進行分析[14]。PCR反應體系為20μL,反應程序參照Wang等[14]的方法。擴增產物用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。3-ADON型菌株預期擴增片段大小為644 bp,15-ADON型為583 bp,NIV型為859 bp[14]。

2 結果與分析

2.1 菌株鑒定結果

引物Fg16F∕R的擴增結果表明,有64株赤霉菌擴增出約500 bp大小的片段,屬于SCAR類型V,1株的擴增片段為410 bp,屬于SCAR類型I。這說明64株赤霉菌屬于F.asiaticum,只有1株屬于F.graminearumsensu stricto(圖2,表1)。從奉賢區小麥中分離得到23株赤霉菌,包括22株F.asiaticum和1株F.graminearumsensu stricto。其余42株均為F.asiaticum,其中,金山區分離得到10株,浦東新區12株,青浦區15株,嘉定區5株。因此,F.asiaticum是引起上海地區小麥赤霉病的優勢病原菌。

圖2 部分菌株Fg16F∕R擴增產物電泳圖Fig.2 Partial results amplified by primer pair Fg16F∕R

表1 供試菌株的來源及產毒化學型鑒定結果Table 1 The origins and chemotypes of strains used in this study

為了對引物Fg16F∕R的鑒定結果進行驗證,選取5株菌株進行TEF基因測序。測序結果在Fusarium ID(http:∕∕isolate.fusariumdb.org∕blast.php)網站進行比對分析。結果表明:1株菌株TEF基因序列與F.graminearumsensu stricto菌株的相似度最高,4株菌株TEF基因序列與F.asiaticum菌株的相似度最高,相似度均大于99%,5株菌株TEF基因序列的比對結果與Fg16F∕R的鑒定結果完全一致。

2.2 菌株產毒化學型分析結果

利用引物Tri13P1∕2對65株赤霉菌進行PCR擴增,發現有48株擴增出644 bp的單一條帶,14株的擴增片段大小為859 bp,其余3株擴增條帶的大小為583 bp(圖3)。表明48株赤霉菌的毒素化學型為3-ADON型,14株為NIV型,3株為15-ADON型。其中,僅有的1株F.graminearumsensu stricto產NIV毒素(表1)。因此,上海地區3-ADON型菌株的比例最高。

圖3 部分菌株Tri13P1∕2擴增產物電泳圖Fig.3 Partial results amplified by primer pair Tri13P1∕2

按地理來源分,奉賢區分離得到的23株赤霉菌有17株3-ADON化學型、2株15-ADON型和4株NIV型;金山區的10株菌株包括7株3-ADON化學型和3株NIV型;浦東新區的12株菌株包括9株3-ADON型和3株NIV型;青浦區的15株赤霉菌有10株3-ADON化學型、4株NIV型和1株15-ADON型;嘉定區的5株菌株則均為3-ADON化學型(表1)。

3 結論與討論

本研究對上海地區小麥赤霉病菌的種群和產毒類型進行了調查,結果表明:上海地區優勢病原菌群體為F.asiaticum,該研究結果與江蘇、安徽、浙江等長江中下游地區已報道的FGSC的分析結果一致。Qiu等[15]對長三角地區江蘇省和安徽省分離的891株赤霉病菌進行了分析,其中F.asiaticum有808株,占90.7%,而F.graminearumsensu stricto只有83株。從安徽、江蘇地區的水稻、玉米和小麥3種作物中分離的FGSC菌株也是以F.asiaticum為主,占75.3%,其中水稻種子中分離的菌株均為F.asiaticum[16]。本研究從上海地區分離到的FGSC菌株中F.asiaticum群體占98.5%,而F.graminearumsensu stricto僅占1.5%(只有1株)。奉賢、金山、浦東、青浦、嘉定5個區只有奉賢區分離到F.graminearumsensu stricto,而其他4個區只分離到F.asiaticum,這可能與樣本大小有關。

溫度、寄主、耕作制度等因素都會影響FGSC的種群分布。已有研究表明,引起中國小麥赤霉病的FGSC群體中,F.graminearumsensu stricto菌株主要分布在年平均氣溫較低的北方寒冷地區,而F.asiaticum菌株則主要分布在南方溫暖區域[7,17]。寄主適應性也是影響菌群分布的原因之一,Lee等[18]對從韓國水稻上分離獲得的356株赤霉菌進行了遺傳多樣性分析,發現F.asiaticum更適宜在水稻生態系統中生存。Gale等[19]的研究也表明,在美國路易斯安納州南部地區的水稻種植區,F.asiaticum群體的比例較高。在中國,F.asiaticum群體主要分布在種植水稻的長江流域[7,15-17,20-22]。

就菌株毒素化學型而言,上海地區FGSC群體中3-ADON、NIV和15-ADON 3種化學型均有分布,所占的比例差異顯著,分別為74%、21%和5%,其中以3-ADON化學型比例最高,這與長三角其他省市的分布趨勢是一致的。依據行政區域進行統計分析,5個區不同化學型菌株的比例分別為:奉賢區3-ADON型占73.91%、15-ADON型占8.70%、NIV型占17.39%;金山區3-ADON型占70%、NIV型占30%;浦東新區3-ADON型占75%、NIV型占25%;青浦區3-ADON型占66.6%、15-ADON型占6.7%、NIV型占26.7%;嘉定區均為3-ADON型。不同區域菌株化學型差異可能與樣本量大小有關。Karugia等[23]對來自浙江的208株F.asiaticum進行了分析,發現3-ADON和NIV型菌株分別占57.7%、42.3%,未檢測到15-ADON化學型。對江蘇和安徽的808株F.asiaticum分析的結果顯示,3-ADON型菌株比例最高,占86.14%,15-ADON和NIV型分別為5.69%和8.17%[15]。從安徽、江蘇地區水稻、玉米和小麥3種作物中分離的F.asiaticum群體3-ADON型菌株占64.4%[16]。因此,長三角地區F.asiaticum3-ADON型菌株占主導地位,屬于優勢菌群。

通常小麥赤霉病以麥穗的單一小穗(中間部位小穗)發病最為常見。本研究在采樣時發現了單一麥穗上2—3個小穗同時發病的現象,即分布在不同部位的物理距離較遠的小穗均表現赤霉病癥狀,以中間小穗和頂部小穗同時發病較為普遍,出現比例約占15%。毒素化學型分析發現,同一麥穗存在不同化學型菌株同時侵染的現象。如在奉賢區采集的同一個麥穗上分離得到了3-ADON型和15-ADON型菌株。多個部位同時侵染不僅加重了病害發生程度,也使得不同毒素交叉污染成為可能,加劇了食品安全風險。

總體來看,無論是長三角地區還是整個長江流域,3-ADON型菌株比例較高(＞60%),明顯處于主導地位,這可能與氣溫、輪作方式、致病力、產毒量等因素有關[22]。生物學表型分析結果表明,3-ADON型菌株在致病力、生長速率、生殖能力、產毒量等方面顯著強于NIV型菌株[21]。Liu等[24]研究表明,不同化學型菌株的分布可能與菌株致病力、生長速率、產子囊殼的數量、產毒量等生物學特征有關,并且3-ADON型菌株產DON毒素的能力強于15-ADON和NIV型菌株。Nicolli等[25]研究發現,通常情況下產DON及其乙酰化衍生物3-ADON或15-ADON毒素菌株的致病力高于NIV型菌株,這一結論與DON毒素在病原菌侵染小麥時具有毒力因子作用[26],可以促進病害擴展的結論是一致的。此外,3-ADON型菌株群體在美國的迅速擴張也說明該群體具有一定的競爭優勢。2000年以前,危害美國和加拿大小麥的赤霉菌幾乎均為15-ADON型,15-ADON型F.graminearumsensu stricto占絕對主導地位[6,27]。但是,近年研究發現,加拿大西部地區15-ADON菌株正逐漸被3-ADON菌株所代替,該地區3-ADON菌株在1998—2004年增加了14倍,已經成為優勢菌群[27]。此外,不同化學型菌株群體之間的同源重組、基因水平轉移等可能也是影響菌群分布的因素之一[21,28-29]。因此,本研究發現的3-ADON和15-ADON菌株同時侵染的現象,應引起重視。最近,在美國北部和加拿大南部地區發現了一個新的產A類單端孢霉烯毒素(NX毒素)的FGSC群體,雖然這一群體的比例較小(1.8%),但值得引起重視[30-31]。目前,我國未發現有產NX毒素的赤霉菌存在,應加強進口小麥等谷物的檢驗檢疫,謹防這一病原菌群體傳入我國。

一直以來,亞洲地區NIV型菌株的比例較其他地區偏高,局部地區NIV型菌株的比例甚至比DON型菌株還高。史文琦等[32]對我國小麥赤霉病流行區域FGSC群體的產毒類型進行了分析,結果表明,產NIV毒素的菌株是長江上游麥區的優勢菌群。對我國19個省份59個地區玉米中FGSC的分析結果表明,NIV型菌株的比例為56.1%[33]。據報道,韓國NIV型菌株的比例高達93.5%[18]。Gale等[19]首次報道了美國存在NIV型菌株,對美國路易斯安納州237株赤霉菌的鑒定結果表明,NIV型菌株占79%,其中路易斯安納南部地區群體NIV化學型高達93.6%。Goswami等[6]研究發現,北美地區NIV型群體有明顯的擴張蔓延趨勢。NIV型菌株的比例呈上升趨勢,這也是赤霉病菌群體結構變化的一個顯著特征,因此,應該加強對田間NIV型菌株的跟蹤調查和監測工作,防止高毒菌株的擴張蔓延。

鐮刀菌毒素膳食暴露評估結果表明,我國小麥粉和玉米制品中NIV毒素的污染水平偏高,存在較高的健康風險。馬玉彤等[34]對我國不同產區214份小麥樣品進行真菌毒素污染分析的結果表明,所有測試小麥樣品均檢測到鐮刀菌毒素,其中以NIV毒素污染最重,含量最高,最大值為393.70μg∕kg,平均值為273.44μg∕kg,即使在含量較低的地區評價含量也高達182.56μg∕kg。研究表明,NIV毒性較強,其對人體細胞的毒性是DON的4倍[35]。體外研究證實,NIV毒素能強烈抑制哺乳動物細胞蛋白、RNA和DNA合成,造成增殖細胞壞死[36]。此外,NIV毒素還可以誘導細胞凋亡、引起免疫抑制等毒害作用。歐洲食品科學委員會建議人和動物每天對DON毒素的攝入量嚴格限制在1.0μg∕(kg bw),對NIV毒素的允許攝入量嚴格限制在0.70μg∕(kg bw)[37]。我國現行食品安全國家標準GB 2761—2017規定,小麥、玉米等谷物及其制品中DON的最大允許量不得超過1 000μg∕kg,但目前還未對NIV毒素做出限量標準。鑒于NIV毒性強、污染比例較高,非常有必要將其列入谷物等農產品限量標準,加強日常食品安全監測。

近年來,長江中下游冬麥區小麥赤霉病持續呈高發態勢,尤其是給長三角地區造成了嚴重的損失,究其原因主要與氣候有關。小麥赤霉病是一種典型的“氣象型”病害,其侵染循環過程與氣象因子息息相關[38]。如果小麥盛花期遇到連續兩天或以上的陰雨天氣就很容易引起赤霉病的大暴發。此外,近幾年實施的秸稈還田制度易使大量菌源積累,而密植栽培、高溫高濕等環境則為病菌侵染和病害流行成災創造了有利的條件。FGSC引起的小麥赤霉病及真菌毒素污染兼具糧食安全和食品安全雙層風險,是國家“藏糧于地、藏糧于技”、“糧食穩產優質”戰略面臨的嚴峻挑戰,開展FGSC菌株致病及產毒機理研究對糧食豐產和品質安全意義重大。