青稞品種‘喜馬拉22號’小孢子培養植株再生體系的建立

郭桂梅,宗營杰?,何 婷,張述偉,杜志釗,陸瑞菊,王亦菲??,劉成洪

(上海市農業科學院生物技術研究所∕上海市農業遺傳育種重點實驗室,上海201106;上海市農業科技服務中心,上海200335)

青稞是我國西藏地區居民的主要食糧,同時還是優良的飼料和釀酒原料,在農業生產中具有重要地位[1]。青稞優良品種的選育關系到我國邊疆地區的糧食安全,具有較為重要的社會經濟效益[2-3]。青稞作為一種可食用的裸大麥,具有“三高兩低”(蛋白質、膳食纖維、維生素含量高;脂肪、糖含量低)的特點,同時還富含β-葡聚糖和黃酮類功能性成分,具有很好的營養保健價值[4-6],正由區域糧食作物轉向全球健康食源作物[7]。‘喜馬拉22號’由西藏自治區日喀則市農業科學研究所選育[8],具有高產、耐逆抗倒、耐旱耐濕等特點,是春青稞良種中產量較高的品種,也是近年來青稞育種中的重要親本來源之一。

青稞生產中存在品種更換周期長、老品種混雜退化嚴重、優異種質資源匱乏等問題[3,9-10],應用小孢子培養技術可以快速純合、穩定優良基因,加快青稞育種進程[11-13]。目前青稞的花藥培養和小孢子離體培養已在一些青稞材料上獲得成功[14-17],但小孢子培養存在基因型依賴性,不同青稞材料的培養反應特性差異較大,‘喜馬拉22號’作為西藏自治區主栽青稞品種,還未見小孢子培養研究成功的報道。本研究對‘喜馬拉22號’游離小孢子培養中的多個環節進行研究,包括供體植株的種植與春化處理、愈傷組織的誘導及分化、再生植株倍性的鑒定及移栽等,以期建立其小孢子培養再生植株體系,為以后青稞的遺傳改良提供單倍體快速育種技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

‘喜馬拉22號’種子由西藏自治區農牧科學院農業科學研究所曾興權博士提供。2018年11月種植于上海市農業科學院南門大田中,2019年春季參照郭桂梅等[18]方法進行取材、修剪及低溫處理。

1.2 春化處理

試驗種子于28℃浸泡6 h后催芽過夜,穴盤種植,3 d后,將幼苗移入5℃冰箱,弱光照(通過冰箱玻璃透明門提供的自然光),處理37 d后,移栽大田。田間直播材料作為對照組。

1.3 小孢子培養方法

選取5℃低溫處理2—3周的青稞穗,剝去葉鞘,參考郭桂梅等[18-19]方法進行消毒、收集游離小孢子。19 d后稱取愈傷組織質量并將愈傷組織轉入分化培養基,25℃、12 h光照培養,進行綠苗統計及壯苗生根培養。

選擇根系發達的再生植株,移出壯苗生根培養基,去除黃葉后在Hoagland營養液中進行水培煉苗,獲得生長健壯植株。同時對水培苗進行染色體倍性鑒定與加倍處理(單倍體植株幼苗剪根,用0.2%秋水仙堿+2%二甲基亞砜浸泡,20℃暗處理12 h),提高其二倍化率。煉苗3—4周后加倍單倍體(Double haploid,DH)植株送往云南昆明基地加代種植,收獲DH株系種子。

1.4 提取液和培養基的配制

誘導培養基以N6為基本培養基,添加0.5 mg∕L KT、0.4 g∕L水解干酪素、1.6 g∕L谷氨酰胺及0.976 g∕L MES,pH 5.8,用0.22μm膜過濾滅菌。麥芽糖設置60 g∕L、75 g∕L、90 g∕L、105 g∕L和120 g∕L 5種濃度,2,4-D設置0.5 mg∕L、1.0 mg∕L、1.5 mg∕L和2.0 mg∕L 4種濃度。

提取液、分化培養基和壯苗培養基成份及滅菌方法均參照郭桂梅等[20]方法。

1.5 生長統計指標

愈傷組織產量:每皿小孢子培養19 d時產生的愈傷組織質量,用“mg”表示;綠苗產量:每皿愈傷組織分化出的綠苗數,用“株”表示;綠苗再生能力:每100 mg愈傷組織分化出的綠苗數,用“株”表示。

1.6 倍性鑒定

選用第3片葉的中部,長度3—4 cm,放入卡諾氏固定液(無水乙醇∶冰乙酸=3∶1,V∕V)中,浸泡至葉片完全褪色,在蒸餾水中漂洗后置于400倍顯微鏡下測量葉片下表皮氣孔保衛細胞長度,每葉片隨機統計10個細胞,取平均值。

每棵苗剪取3條根尖,長度1—2 cm,放入預冷的90%冰醋酸中,放置10 min后取出,用吸水紙吸干,放入70%乙醇中,-20℃保存放置。45%冰醋酸中解離制片,每個片子至少觀察5個分裂相。

1.7 田間調查

考察大田種植的‘喜馬拉22號’株高、分蘗、穗長、穗粒數、癟粒數、單株產量及千粒重等農藝性狀,千粒重測定重復3次,其余均重復5次。穗密度=穗粒數∕穗長;結實率=(穗粒數-癟粒數)∕穗粒數×100%。

1.8 數據處理

采用Excel 2010、DPSv7.05軟件進行數據處理與分析。

2 結果與分析

2.1 春化處理對小孢子愈傷組織誘導的影響

春化處理組單皿小孢子培養誘導愈傷組織的產量均高于對照組。對照組單皿愈傷組織產量均值為33.27 mg,春化處理后其愈傷組織產量提高了1倍,達到66.57 mg,兩個處理間存在極顯著差異。

2.2 誘導培養基中麥芽糖濃度對小孢子培養愈傷組織誘導的影響

由圖1可知,麥芽糖質量濃度在90 g∕L和105 g∕L時小孢子愈傷組織產量顯著提高,其中麥芽糖質量濃度為90 g∕L時,愈傷組織產量最高(57.12 mg)。

圖1 誘導培養基中麥芽糖濃度對愈傷組織誘導的影響Fig.1 Effects of maltose concentration in induction medium on the yields of callus

2.3 誘導培養基中2,4-D濃度對小孢子培養愈傷組織誘導的影響

由圖2可知,2,4-D質量濃度為1.5 mg∕L時,愈傷組織產量誘導最高,達56.50 mg,與其他濃度處理存在顯著差異。

圖2 誘導培養基中2,4-D濃度對愈傷組織誘導的影響Fig.2 Effects of 2,4-D concentration in induction medium on the yields of callus

2.4 小孢子植株的再生、生根與移栽

在優化后的愈傷誘導條件下,成功獲得青稞‘喜馬拉22號’游離小孢子胚性愈傷組織和分化綠苗,平均每皿可以誘導出92.3 mg愈傷組織,平均每皿愈傷組織能分化出56.5株綠苗,平均每100 mg愈傷組織能分化出60.9株綠苗。當分化苗長至1.5—2.0 cm高時,及時轉移至生根壯苗培養基上,4周后將再生植株經過水培煉苗后移栽至盆缽(圖3)。

圖3 小孢子培養愈傷組織誘導及植株再生Fig.3 Callus induction and plants regeneration of isolated microspore culture

2.5 小孢子再生植株的倍性鑒定

對56株小孢子來源的‘喜馬拉22號’再生植株進行染色體倍性鏡檢,單倍體為7條染色體(n=7),二倍體為14條染色體(2n=14),四倍體為28條染色體(2n=28)(圖4)。56株再生植株中3株為單倍體植株,占5.4%;32株為二倍體植株,占57.1%;21株為四倍體植株,占37.5%。

圖4 不同倍性的小孢子再生植株的染色體鏡檢(400×)Fig.4 Chromosomal microscopy of microspore regeneration plants with different ploidy

測量‘喜馬拉22號’小孢子培養獲得的56株再生植株和20株種子苗葉片保衛細胞長度,發現單倍體葉片保衛細胞長度為36.71—39.93μm,二倍體葉片保衛細胞長度為42.29—60.38μm,四倍體葉片保衛細胞長度為59.98—93.49μm(圖5)。其均值長度呈正態分布,單倍體葉片保衛細胞長度平均值為38.83μm,二倍體平均值為51.94μm,四倍體平均值為71.18μm,種子苗平均值為57.13μm(圖6)。

圖5 小孢子再生植株的單倍體、二倍體、四倍體的保衛細胞Fig.5 The guard cells of monoploid,diploid,and tetraploid from the microspore regeneration plants

2.6 大田適應性

試驗表明,青稞‘喜馬拉22號’在上海地區種植能正常完成整個生育期,且其籽粒結實率在97%以上;春化處理與對照組在株高、穗密度和單株產量上均存在顯著性差異(表1)。

表1 上海地區種植的‘喜馬拉22號’的農藝性狀Table 1 Agronomic character of field grown locally in Shanghai of‘Himala 22

3 討論與結論

春青稞‘喜馬拉22號’適宜在西藏自治區海拔4 300 m以下中高肥水農田種植,在上海地區也能正常完成生育期,但在兩地種植植株的一些基本農藝性狀有一定差異[8]。如在西藏地區種植時,‘喜馬拉22號’全生育期134 d,株高94.7 cm,穗長6.02 cm,平均穗粒數53.6粒,平均千粒重42.9 g;而在上海地區種植時,春化處理和對照組其全生育期分別為217 d和194 d,株高分別為121.6 cm和105.5 cm,穗長分別為6.9 cm和8.0 cm,平均穗粒數分別為82.8粒和81.6粒,平均千粒重分別為49.1 g和48.2 g。其差異可能是因種植方式和生產條件的不同所致。

本研究發現,春化處理更利于春青稞‘喜馬拉22號’游離小孢子愈傷組織的形成,其原因可能是低溫條件可促進花芽的形成和花器官的發育[21-22],誘導體內核酸蛋白質代謝發生變化,改變體內激素水平、酶活性及DNA甲基化等[23-24]。小孢子供體植株低溫預處理對象主要是幼穗,目前,關于在幼苗期進行低溫預處理的報道較少,劉成洪等[17]認為,幼苗10℃低溫處理1個月可以提高愈傷和綠苗產量。麥芽糖在誘導培養基中不僅可作為碳源,還可以調節誘導培養基的滲透壓,對小孢子的孢子體啟動起著重要作用;激素2,4-D有利于小孢子的脫分化啟動,因此,麥芽糖和2,4-D的濃度是否合適對小孢子培養成功與否十分關鍵[16]。本研究發現,誘導培養基中麥芽糖質量濃度為90 g∕L時和2,4-D質量濃度為1.5 mg∕L時可顯著增加愈傷組織產量。

花藥∕小孢子再生植株的倍性可以通過葉片保衛細胞長度來確定[25-28],而根尖染色體制片計數是經典的植株倍性鑒定方法。本研究表明:‘喜馬拉22號’單倍體和二倍體(加倍單倍體)的界限值為40μm,比大麥上的界限值37μm略大[27],這可能和研究群體的大小和葉齡有關。‘喜馬拉22號’小孢子再生植株的倍性鑒定結果表明,相比大麥小孢子再生植株,其單倍體比例較低,四倍體比例較高,這與青稞材料小孢子培養中自發加倍的頻率有關。而青稞小孢子再生植株葉片保衛細胞長度的分布、自發加倍頻率與前期大麥的研究結果之間存在差異的原因還有待于進一步研究。