瓜類果斑病菌熒光免疫層析試紙條的研制

曾海娟,翟緒昭,孫靜娟,王金斌,劉 箐?

(1上海市農業科學院生物技術研究所,上海201106;2上海理工大學醫療器械與食品學院,上海200093)

瓜類細菌性果斑病(Bacterial fruit blotch,BFB)是一種由革蘭氏染色呈陰性的燕麥食酸菌西瓜種(Acidovorax citrulli,Ac)引起的具有毀滅性的細菌性病害。瓜類果斑病菌是典型的種傳病菌,可通過帶菌種子實現遠距離傳播,因此,帶菌種子是果斑病爆發的重要來源[1]。果斑病菌抗干旱能力非常強,可在干燥的種子表面存活35年[2],并且可侵染西瓜、甜瓜、南瓜等多種葫蘆科植物的果實、植株及種子,使帶菌果實表面出現水漬狀斑點,最終導致整個果實腐爛,嚴重影響瓜類產量,造成巨大的經濟損失。目前,尚未培育出可以完全抵抗該病菌的商業化瓜類品種[3]。

聚合酶鏈式反應(PCR)是用于病原菌檢測的標準方法,如常規PCR、多重PCR[4]、實時熒光定量PCR[5]、鎖式探針擴增[6]及環介導等溫擴增[7]等。基于PCR的檢測方法靈敏度較高,與傳統的以培養為基礎的檢測方法相比,檢測時間較短,只需3—4 h即可獲得可靠的結果。但該方法需要精密的熱循環儀,對操作人員也有一定的技術要求。免疫層析試紙技術是基于免疫學建立的檢測方法,其操作簡單,檢測時間短,結果易辨認,樣品不需要前處理,且不需要復雜的設備。試紙條中最常見的標記材料是應用膠體金作為示蹤物,標記抗體后使得檢測結果肉眼可見。目前,已廣泛用于大腸桿菌、副溶血性弧菌、腸炎沙門氏菌等食源性致病菌的快速檢測[8-10],黃瓜角斑菌、玉米條斑病菌等植物病原菌的田間快速檢測[11-12],玉米赤霉烯酮、黃曲霉素等真菌毒素的檢測[13-14]。近年來,一些新型的標記材料獲得越來越多的關注,其中包括上轉化發光納米粒子[15]、稀土納米材料[16]、量子點[17]、熒光微球[18]等。

異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)是一種熒光染料,可以吸收藍光或紫外光并發出黃綠色熒光。作為一種熒光探針,FITC被廣泛用于活細胞染色以及細菌染色后的示蹤[19-20]等。本研究在前期制備得到高特異性單克隆抗體的基礎上,采用FITC標記抗體,利用“雙抗體夾心”模式制備新型的熒光免疫層析試紙條,并對試紙條的性能(特異性、靈敏度、穩定性)及對實際樣品的檢測結果進行分析,旨在建立一種新型的簡便、快速、成本低的檢測果斑病菌的免疫學新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

果斑病菌SD01的單克隆抗體6D及4F由本試驗室制備并保存;用于測定試紙條特異性的菌株見表1,其中7種野生型果斑菌株(編號1—7)由中國檢驗檢疫科學研究院從國內外瓜類產品中分離所得,已進行了分離鑒定及柯赫氏法則驗證;其余菌株(編號8—14)均為標準菌株。硝酸纖維素膜(NC膜)、樣品墊(20 cm×30 cm)、結合墊(20 cm×30 cm)、吸水紙(20 cm×30 cm)購自美國Millipore公司。

表1 試驗所用菌株Table 1 Bacterial strains used in the test

1.2 試劑

腦心浸液培養基(BHI)購自北京陸橋技術股份有限公司;羊抗鼠IgG抗體和FITC(≥90%)購自美國Sigma公司;其余試劑均為分析純。

1.3 主要儀器

SpectraMax M2多功能酶標儀購自美國Molecular Devices公司;點樣儀購自美國BioDot公司。

1.4 細菌抗原制備

使用腦心浸出液培養基(BHI)進行果斑病菌培養[21]。將冷凍保存的果斑病菌及其近源菌株劃線接種于BHI平板,37℃過夜培養后挑取單菌落接種于液體BHI培養基中,37℃搖床培養12 h后,菌液采取0.3%甲醛滅活用作檢測抗原。純培養的各種菌株在甲醛滅活前均用無菌生理鹽水梯度稀釋并涂布于BHI平板進行菌落計數。

1.5 果斑病菌單抗的熒光標記

將待交聯的單克隆抗體4F在交聯反應液中透析過夜,交聯反應液的配方為:7.56 g NaHCO3,1.06 g Na2CO3,7.36 g NaCl,加水定容到1 L。按單抗4F∶FITC=1 mg∶150μg的比例將新鮮配制的FITC緩慢加入抗體溶液中,邊加邊輕輕晃動使其與抗體混合均勻,置于室溫反應2 h。將交聯物在PBS中透析,至透析液清亮。FITC交聯的抗體置于pH 7.4的磷酸鹽緩沖液中4℃避光保存。交聯效果判定方法為FITC∶抗體=2.77×OD495∕[OD280-0.35×OD495],該值應為5—10[22]。

1.6 檢測線濃度及熒光抗體使用量的優化

為確定最適的檢測線濃度,將不同質量濃度的單克隆抗體6D(2.5 mg∕mL、2 mg∕mL、1.5 mg∕mL)與1 mg∕mL羊抗鼠IgG抗體噴涂于NC膜上分別形成檢測線與質控線,再將NC膜(2.5 cm×30 cm)、結合墊(0.5 cm×30 cm)、樣品墊(2.5 cm×30 cm)、吸水紙(3 cm×30 cm)依次貼在PVC底板(8 cm×30 cm)上,并互相重疊1—2 mm,如圖1A所示,切成3 mm左右的條帶?？瞻譈HI培養基75μL逐滴滴加至樣品墊,作為陰性對照。判定最適的檢測線(T線)濃度:只出現一條質控線(C線)的抗體6D最高濃度。

圖1 試紙條的模擬結構(A)及陽性結果(B)和陰性結果(C)Fig.1 The simulated structure(A),positive result(B)and negative result(C)of the test strip

優化后的單克隆抗體6D與1 mg∕mL羊抗鼠二抗噴涂于NC膜上,并進行試紙組裝。將不同質量(2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg)的熒光抗體4F噴涂于試紙條的結合墊,空白培養基滴加至樣品墊作為陰性對照,最適熒光抗體(FITC-4F)的質量為僅出現一條質控線(C線)時的最高熒光抗體量。

檢測原理為:當樣品中含有待檢靶標時,樣品中的抗原首先與結合墊上的熒光抗體結合,形成熒光抗體4F-抗原復合物,當復合物流經NC膜上的檢測線時,與檢測線上的6D結合,形成熒光抗體4F-抗原-抗體6D“雙抗體夾心”模式,由于FITC在T線和C線上的堆積,在檢測線及質控線區域產生肉眼可見的黃綠色熒光(圖1B);當樣品中無待測靶標時,FITC不會在T線上堆積,僅可見一條C線(圖1C)。

1.7 試紙條特異性測定

采用無菌生理鹽水將8種果斑病菌(SD01、ATCC 29625、99-5、xj112、PLSB1、00-1、plsb91、tw31),及6種同屬近源的植物病原菌(ATCC33996、NCPPB961、ATCC19307、NCPPB2597、NCPPB540、ATCC2975)的菌懸液稀釋至108CFU∕mL,并滴加75μL至相應試紙條的樣品墊。靜置10 min后在紫外燈下觀察結果,用裝有熒光濾光片(525 nm,Semrock,USA)的相機拍照記錄檢測結果。當試紙條出現兩條線時,判定為陽性;若試紙條只有一條C線,則判定為陰性;若無線或者只有一條T線則判定為無效結果。若8種果斑病菌均能檢出,而6種近源的植物病原菌不能檢出,則表明該試紙條在檢測果斑菌時具有較高的特異性。

1.8 試紙條靈敏度和穩定性測定

用無菌生理鹽水將果斑病菌SD01懸液按10倍梯度稀釋為3.1×105—3.1×108CFU∕mL,以空白BHI培養基作為陰性對照,每個樣品在試紙條的樣品墊逐滴滴加75μL,10 min后觀察結果?？梢杂^察到出現兩條線的最小細菌懸液濃度,即為該試紙條的檢出限。

將制備好的試紙條室溫放置3月后,通過測定試紙條的靈敏度來評估試紙條的穩定性。試驗方法同上,若檢出限未發生變化,則表明試紙條在室溫存放3個月后仍具有穩定檢出果斑病菌的能力。

1.9 實際樣品的檢測

將經PCR驗證無果斑病菌污染的葫蘆科植物西瓜、甜瓜、哈密瓜、南瓜、黃瓜、冬瓜、絲瓜、西葫蘆的莖葉搗碎,收集汁液5 mL分別添加到45 mL BHI中,并接種果斑病菌SD01單菌落,37℃過夜培養后,菌濃度調至3.1×106CFU∕mL,每個樣品在試紙條的樣品墊上逐滴滴加75μL,10 min后在紫外燈下觀察結果。若上述樣品均可以檢出,則說明試紙條在檢測樣品時,最小檢出濃度不受瓜類莖葉中未知雜質的影響,該試紙條適用于實際樣品的現場快速檢測。

2 結果與分析

2.1 細菌計數結果

使用BHI液體培養基37℃培養12 h,14種細菌濃度均在2×109—4×109CFU∕mL,其中用于測定靈敏度的野生型菌株SD01平板計數結果為3.1×109CFU∕mL。

2.2 單抗的熒光標記效果測定

采用酶標儀測定單抗4F與FITC的交聯比例,計算得到2.77×OD495∕[OD280-0.35×OD495]值為9.45,nanodrop測定標記后單抗質量濃度并調整為2 mg∕mL。由圖2可見,在280 nm處有蛋白的最大吸收峰,在495 nm處有FITC的最大吸收峰,表明FITC標記抗體成功。

圖2 熒光抗體全波長掃描Fig.2 Full wavelength scanning of fluorescent antibody

2.3 檢測線濃度的確定

空白BHI培養基用來確定試紙條的最適檢測線濃度,選取檢測結果不出現假陽性的最高檢測線濃度為最適濃度。將75μL空白BHI培養基滴加至不同檢測線濃度的試紙條的樣品墊,當檢測線質量濃度為2.5 mg∕mL時,試紙條測定空白BHI培養基時出現假陽性結果,檢測線6D質量濃度低于2 mg∕mL時,只有一條質控線質量,因此本試驗選取最適檢測線質量濃度為2 mg∕mL。

2.4 熒光抗體最適量的確定

空白BHI培養基用來確定熒光抗體的最適量,先在試紙條的結合墊上噴涂不同質量的熒光抗體,再將空白培養基滴加至試紙條的樣品墊,如圖3所示,當熒光抗體的量達到6μg時,試紙條檢測空白培養基出現假陽性結果,因而最適熒光抗體的噴涂量為5μg。

圖3 最適熒光抗體量的確定Fig.3 Determination of the optimal amount of fluorescent antibody

2.5 試紙條的特異性測定

由圖4所示,試紙條1—8檢測8種果斑菌,有兩條線,為陽性結果;9—14檢測與果斑病毒近源的植物病原菌,只有一條質控線,為陰性結果;0為陰性對照,表明試紙條可以檢出該8株果斑病菌,并且與其他近源的植物病原菌無交叉反應,具有良好的特異性。

圖4 試紙條的特異性測定Fig.4 Determination of specificity of test strip

2.6 試紙條的靈敏度測定

試紙條對野生型菌株SD01的檢測靈敏度結果如圖5所示,菌液濃度在3.1×106—3.1×108CFU∕mL時可見兩條線,為陽性結果;濃度為3.1×105CFU∕mL時只有一條質控線,為陰性結果,因而試紙條的檢測靈敏度為3.1×106CFU∕mL。

圖5 試紙條的靈敏度測定Fig.5 Sensitivity determination of test strip

2.7 試紙條的穩定性

將研制的熒光試紙條室溫放置3個月后,檢測靈敏度仍能達到3.1×106CFU∕mL,表明試紙條最少可以在室溫存放3個月,仍具有檢測果斑病菌的能力。

2.8 試紙條檢測實際樣品

試紙條對含有3.1×106CFU∕mL果斑病菌SD01的8種葫蘆科植物的檢測結果如圖6所示,試紙條1—8均有兩條線,為陽性結果;試紙條0僅有一條質控線,為陰性結果,表明汁液中的未知雜質不會對試紙條的檢測結果產生影響,試紙條可用于田間實際樣品的快速檢測。

圖6 試紙條的實際樣品檢測Fig.6 Actual sample detection of test strip

3 討論

試紙條的特性與抗體的特性直接相關,試驗中所用單克隆抗體6D、4F為前期試驗所得[21],6D效價為1∶6 400,可識別并結合8種果斑病菌,與6種近源植物病原菌無交叉反應;4F效價為1∶6 400,可識別并結合8種果斑菌,但與ATCC19307、ATCC33996有交叉反應。試紙條的研制是建立在“雙抗體夾心”技術基礎上的,ATCC19307、ATCC33996雖然與單克隆抗體4F存在交叉反應,但與固定在檢測線區域的單克隆抗體6D不能結合,因而制備出的熒光試紙條與這兩株菌并無交叉反應。

目前報道的果斑病菌的檢測方法主要有PCR法、酶聯免疫吸附測定法[23]、膠體金免疫層析試紙條[24]等。熒光免疫層析法是目前一種新型的免疫學檢測技術,可用于病原菌的快速檢測。熒光免疫層析法的熒光標記物質常見的有熒光素、量子點及一些熒光乳膠微粒等,FITC作為一種熒光染料,價格低廉,可降低試紙條的成本。本試驗以FITC為標記物,利用熒光免疫層析試紙條選出可以配對的抗體,成功研制出果斑病菌的熒光免疫層析試紙條,并對熒光試紙條的檢測靈敏度、特異性、穩定性及實際樣品檢測結果進行了分析,結果表明試紙條的靈敏度、特異性及穩定性良好,可用于實際樣品的快速檢測,特別適用于無復雜儀器設備的田間、倉儲等場所的大批量樣品的快速篩查,具有方便、快速、操作簡單、檢測結果肉眼可見等優勢。