miR-138-5p通過調控Survivin表達對食管鱗癌細胞活性的影響

哈斯也提·艾力，妮拉·馬哈德，帕力達·帕拉哈提，崔曉賓

食管鱗癌是消化道類惡性疾病，其發生率男性高于女性[1]，食管鱗癌發病因素主要有長期進食熱燙食物、煙酒、煙熏、腌制食物、遺傳、基因突變等[2]。食管鱗癌的早期病變多限于黏膜，表現為黏膜充血、糜爛，呈斑塊兒和乳頭狀，少見腫塊。中晚期腫塊逐漸累積增加并凸入腔內穿透食管進入中隔癌細胞[3]。食管鱗癌具有強侵襲、易復發、預后差等特點。相關研究表明，基因分子對食管鱗癌的治療具有一定的效果。生存素（Survivin）是凋亡抑制因子的一種，且抑制凋亡能力較強，在正常機體中水平較低，在癌癥中水平升高，其水平的高低與腫瘤產生及發展聯系密切[4]。微小RNA在多種腫瘤的產生及發展中發揮著重要作用，可通過與其靶基因結合進而調控基因的表達，與細胞的增殖、凋亡等聯系密切，miR-138-5p是微小RNA之一，已有研究證實[5]miR-138-5p在肺癌中具有一定的作用，過表達的miR-138-5p可抑制肺癌細胞的增殖、并促進肺癌細胞的凋亡。尚未有關報道明確證實其對食管鱗癌細胞具體的作用，因此本文研究miR-138-5p通過調控Survivin的表達對食管鱗癌細胞活性的影響。

1 材料和方法

1.1 一般資料食管鱗癌細胞系EC8733、EC8501、EC109、EC9706細胞來自上海冠導生物公司。收集喀什地區第二人民醫院2018年1月至2020年1月食管鱗癌組織及其癌旁組織標本24例；男性14例、女性10例、年齡（55.65±5.18）歲、腫瘤長度＜5 cm、病理分期：T1-T2期9例、T3期15例。所有食管癌患者術前均未接受過放、化療。清潔級SD大鼠20只，購自長沙天勤生物技術有限公司，鼠齡9～11周，體質量200～300 g，動物許可證號：SCXK（湘）20190018，無菌環境常溫飼養，自由飲食飲水，1周后進行實驗。本研究經醫學倫理委員會獲得批準（批號：Y2018-024-05），所有患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 實驗試劑胰蛋白酶（山西利德生物制品有限公司）；Primer 5.0軟件（北京中科瑞泰生物科技公司）；CCK-8試劑（武漢卡諾斯科技有限公司）；酶標儀（山東恒美電子科技有限公司）；結晶紫染色液（上海如吉生物科技發揮有限公司）；流式細胞儀（江蘇新力科技實業有限公司）；miR-138-5p引物、lipofectamine TM 2000脂質體（百奧邁科生物技術有限公司）。

1.3 細胞培養與分組取食管鱗癌細胞系EC8733、EC8501、EC109、EC9706細胞，運用RPMI 1640培養液培養，36 h后更換培養基。常規條件下培養，取對數期細胞進行試驗。

miR-138-5p的轉染：將細胞接種于6孔板中培養。直至細胞長到45%～55%時，按說明書操作，用lipofectamine TM 2000轉染50 nmol/L相應的miR-138-5p mimics、miR-138-5p-NC，轉染培養9 h后，更換新鮮培養液繼續培養3 d后即可進行實驗。實驗分為W組（無轉染組）、C組（食管鱗癌細胞轉染NC組）、Z組（轉染miR-138-5p組）。

1.4 動物實驗取20只大鼠，分為食管癌組（注射食管鱗癌細胞）、miR-138-5p組（注射轉染miR-138-5p食管鱗癌細胞），每組各10只。各組于右側前肢腋下注射相應0.5 mL細胞懸液建立移植瘤模型，4 d后腫瘤體積約為100 mm，表示建模成功。

1.5 檢測指標

1.5.1 RT-PCR檢測Survivin、miR-138-5p水平取W組、C組、Z組食管癌細胞及食管鱗癌組織、癌旁組織標本運用胰蛋白酶消化后提取細胞懸液，沖洗，放于無菌試管中。TRIzol法提取總RNA，Primer5.0軟件設計合成引物。將逆轉后所得的cDNA進行熒光反應實驗。所有反應嚴格按照反應的條件進行擴增，PCR反應條件：94℃、4 min;94℃、30 s；58℃、30 s；2℃、30 s。取PCR產物（5 μL）進行電泳分析（瓊脂糖凝膠1.5%），以GAPDH為內參，共40個循環，取得到的平均值后得到Ct值，計算方法用2-△△Ct法進行分析，引物序列，表1。

表1 引物序列

1.5.2 Western blot檢測取W組、C組、Z組細胞，裂解液裂解并提取蛋白,并對蛋白的濃度進行測量，分裝后，保存在-20℃的環境中。將提取出的蛋白溶液和緩沖溶液進行混均，然后將其煮沸、變性。把電泳后的50 μm蛋白移至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉1 h。加入1抗后PBS漂洗3次，每次間隔10 min，最后加入2抗對溶液稀釋，常溫封閉1 h。取出PVDF膜，上述方法漂洗，DAB顯色后照相。

1.5.3 Transwell小室測遷移能力取W組、C組、Z組細胞，用DMEM培養液重懸后將細胞懸液（6×104/孔）加入Transwell小室的上室，下室加入1 mL含10%FBS的高糖DMEM培養液。培養72 h后取出小室，PBS漂洗2次，4%的多聚甲醛溶液固定15 min，用棉簽擦去上層細胞，加入0.1%結晶紫染色液染色15 min。自來水沖洗3次，顯微鏡拍照。實驗重復3次。

1.5.4 CCK-8檢測食管鱗癌細胞增殖情況取W組、C組、Z組細胞，離心5 min，1250 r/min，制成細胞懸液，接種于96孔板中（4×103個細胞）。分別于細胞貼壁后24、48、72 h加入CCK-8試劑，避光孵育3 h。酶標儀檢測450 nm處OD值。

1.5.5 流式細胞儀檢測食管鱗癌細胞凋亡情況

取W組、C組、Z組細胞接種于6孔板中，胰酶消化，完全培養基終止；PBS清洗，進行細胞計數，離心5 min、1250 r/min，棄上清，混入500 μLBinding Buffer（結合緩沖液）重懸。加入5 μLAnnexinV-FITC混勻、10 μL PI混勻，常規孵育15 min后，流式細胞儀檢測。

1.5.6 雙熒光素酶報告基因檢測實驗將2×105個/孔細胞接種于6孔板中，待細胞生長融合至80%時，參照LipofectamineTM2000轉染試劑說明書將構建好的Survivin′-UTR-WT和Survivin′-UTR-MUT質粒轉染miR-NC（NC組），miR-138-5p mimics（miR-138-5p組）共轉染至細胞，按照雙試劑盒操作步驟檢測各組細胞熒光素酶活性。

1.5.7 觀察各組大鼠移植瘤生長情況建模成功4周后處死大鼠，測量腫瘤病灶的長徑以及與其垂直的短徑，計算瘤體積；同時稱瘤質量，計算抑瘤率。

1.6 統計學處理采用SPSS 18.0統計軟件進行分析，W組、C組、Z組3組食管鱗癌細胞增殖、遷移、Survivin水平等影響的比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，計量資料以均數±標準差（±s），P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-138-5p、Survivin水平檢測結果miR-138-5p在食管癌組織中的表達水平低于癌旁組織（P＜0.05）；Survivin在食管癌組織中的表達水平高于癌旁組織（P＜0.05），圖1。

圖1 癌組織組與癌旁組織組miR-138-5p、Survivin水平比較*表示與癌組織組比較（P＜0.05），實驗重復3次

miR-138-5p在食管鱗癌細胞系EC9706細胞中表達最低（P＜0.05），且Survivin在食管鱗癌細胞系EC9706細胞中表達最高（P＜0.05），因此選擇EC9706細胞進行本次實驗，圖2。

圖2 各細胞中miR-138-5p、Survivin水平表達

miR-138-5p、Survivin在W組與C組中的水平較為接近，組間比較差異無意義（P＞0.05）；在Z組中miR-138-5p的水平有所上升、Survivin水平有所下降，組間比較差異有統計學意義（P＜0.05），由此可看出，miR-138-5p轉染成功，圖3。

圖3 miR-138-5p、Survivin在W組、C組、Z組細胞中的水平與W組比較，P*＜0.05、與C組比較，P#＜0.05，實驗重復3次

2.2 Notch1、HIF-1α、MMP-9水平的檢測結果W組與C組中Notch1、HIF-1α、MMP-9水平較為接近，組間比較差異無意義（P＞0.05）；與W組、C組比較，Z組中Notch1水平有所升高、HIF-1α、MMP-9水平有所下降，組間比較差異有意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 三組Notch1、HIF-1α、MMP-9水平比較

2.3 食管鱗癌細胞遷移能力W組食管鱗癌細胞遷移數量（282.67±27.65）與C組細胞遷移數量（279.31±28.22）相差較小，組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）；與W組、C組比較，Z組中的遷移數量（76.57±6.71）有所降低，組間比較差異有意義（P＜0.05），圖5。

圖5 W組、C組、Z組食管鱗癌細胞遷移情況比較與W組比較，P*＜0.05、與C組比較，P#＜0.05，實驗重復3次

2.4 食管鱗癌細胞增殖情況W組與C組在24、48、72 h的OD值較為接近，組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）；Z組在各時間點的OD值均較W組與C組低，組間比較差異有統計學意義（P＜0.05），表2、圖6。

表2 三組不同時間點OD值的比較（±s）

表2 三組不同時間點OD值的比較（±s）

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圖6 三組食管鱗癌細胞不同時間點OD值比較與W組比較（P*＜0.05）、與C組比較（P#＜0.05），實驗重復3次

2.5 食管鱗癌細胞凋亡情況W組食管鱗癌細胞凋亡率（2.47±0.11）%與C組食管鱗癌細胞凋亡率（2.45±0.13）%較為接近，組間比較差異無意義（P＞0.05）；Z組食管鱗癌細胞凋亡率（13.32±1.23）%高于W組與C組，組間比較差異有意義（P＜0.05），見圖7。

圖7 三組食管鱗癌細胞凋亡情況比較，實驗重復3次

2.6 雙熒光素酶檢測報告結果結果顯示Survivin′-UTR-WT在miR-NC組表達水平為（0.79±0.09）、miR-138-5p組表達水平為（0.59±0.07），組間比較差異有統計學意義（P＜0.001）；Survivin′-UTRMUT在miR-NC組（0.91±0.11）及miR-138-5p組（1.02±0.12）表達無統計學差異（P＞0.05），說明Survivin是miR-138-5p的直接靶點，圖8。

圖8 熒光素酶報告圖

2.7 各組移植瘤生長情況與食管癌組比較，miR-138-5p組大鼠移植瘤的瘤體積、瘤質量降低，抑瘤率升高（P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠移植瘤生長情況（±s）

表3 各組大鼠移植瘤生長情況（±s）

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3 討論

目前，中國是食管鱗癌的高發地區，發病率位列惡性腫瘤的第四位，且有逐年增長的趨勢[6]。威脅患者的生命健康安全，尋求新的食管癌分子靶向治療方法迫在眉睫，因此本文運用miR-138-5p調控Survivin對食管鱗癌進行治療，具體分析如下。

在腫瘤的產生與發展過程中，微小RNA通過調節基因的表達，從而調控細胞的生物活性，間接發揮促癌或抑癌的作用，已有研究證實[7]微小RNA在多種腫瘤中參與癌細胞的增殖、遷移等，miR-138-5p是miRNA的 一 種。miR-138-5p可通過 靶 向調控其下游基因進行調控細胞的生物活性，Survivin是miR-138-5p的下游基因之一，可直接作用其上下游分子，對細胞凋亡途徑具有抑制作用，在正常機體中水平較低，在癌癥中水平升高，其水平的高低與腫瘤的產生與發展密切相關，是抑制細胞凋亡的重要基因之一[8-9]。經本文研究發現在經過轉染miR-138-5p模擬物后，miR-138-5p水平有所增加，Survivin水平有所下降。YangR等[10]研究提示，miR-138-5p與Survivin為負相關，miR-138-5p直接識別并結合Survivin mRNA轉錄，從而抑制Survivin在膀胱癌細胞中的作用，降低癌細胞的增殖與侵襲能力。張志明等[11]對前列腺癌的實驗研究中提出，基因敲除SIRT1靶向結合miR-138-5p具有促進癌細胞凋亡的作用。本文研究與上述研究結果相似。且本文熒光酶報告結果、以及動物實驗結果表明轉染miR-138-5p具有一定的抑瘤作用。

Notch信號通路可調控細胞的分化，根據近年來的研究發現[12-13]，Notchl信號還與腫瘤的產生密切相關，其表達水平的變化還起著抑癌或促癌的作用；有關研究指出[14-15]，當小鼠體內的Notchl被敲除時，小鼠的皮膚發生增殖、基地細胞樣癌形成，其原因與Notchl信號通路被激活引起與細胞凋亡相關途徑發生改變有關。HIF-1α是一種調控細胞增殖和血管進化相關基因轉錄的重要因子，在多種腫瘤中均呈現高表達[16]。miRNA具有轉錄后調控因子水平的作用，多項研究已證實miR-138-5p與HIF-1α具有一定的相關性[17]。腫瘤細胞或周圍間質細胞可分泌出MMP，可降解細胞外基質以及細胞間的黏附、促進新生血管生成從而增加癌細胞的活性，MMP-9是金屬機制蛋白酶之一，且其與腫瘤的發生發展密切相關[18-19]。miR-138-5p定位于chr16染色體，在多種腫瘤中均為低表達，發揮抑癌作用，對腫瘤細胞的增殖、遷移具有一定的抑制作用[20]。經本文研究表明，經過轉染miR-138-5p模擬物后，Notch1水平升高，HIF-1α、MMP-9水平降低。史永亮[21]提示Notch1、Survivin在甲狀腺乳頭狀癌中呈負相關關系，與癌細胞的轉移和侵襲聯系密切。在王麗萍[22]等對試食管鱗癌的實驗中提出，Notch1與食管鱗癌的產生、發展和轉移聯系密切，可評估食管鱗癌病情的嚴重程度。趙軍華等[23]研究提示，HIF-1α是miR-138-5p的靶基因，在腎癌細胞中miR-138-5p通過靶向調控的表達HIF-1α削弱了癌細胞的增殖、侵襲并抑制了其凋亡。在劉正端等[24]對食管鱗癌細胞研究的實驗中發現，MMP-9水平升高，食管鱗癌細胞的侵襲與轉移加劇。尚雙艷[25]提示Survivin與MMP-9在胃癌中具有正相關關系。本文研究與上述研究結果相似，均認為提高Notch1的表達，降低HIF-1α、MMP-9水平可抑制腫瘤發展，因此本文推測，miR-138-5p通過靶向調控Survivin及HIF-1α的表達間接提高Notch1的水平，抑制了MMP-9表達，從而抑制了食管鱗癌的發展。且CCK8測增殖、Transwell小室測細胞遷移以及流式細胞儀測凋亡結果均可證實上述結論。

綜上所述，miR-138-5p可通過降低Survivin的表達，抑制食管鱗癌細胞的增殖及遷移，并促進其凋亡，其作用機制可能與HIF-1α、Notch1及MMP-9表達有關。