基于網絡藥理學與GEO差異基因芯片數據分析復方苦參注射液治療宮頸癌的機理和分子靶點

包君麗,高欣元,韓宇博,林海燕,彭坤明,鄭義

宮頸癌是僅次于乳腺癌的一種常見的婦科腫瘤疾病[1]。研究顯示造成宮頸癌病變的主因是高危型人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染[2-3]。目前宮頸癌的主要治療方案是手術和放化療治療，但療效有限，易復發。新型免疫治療，如抗體靶向治療和過繼細胞治療的療效也不理想[4-5]。

古代中醫醫籍雖沒有與宮頸癌同名病例，但依據其臨床癥狀可將其歸屬于“崩漏”、“五色帶下”、“癥瘕”等范疇，該范疇之內中醫具有豐富的治療案例[6]。近些年來中醫藥在宮頸癌的治療過程中取得了不錯的進展[7]。大量的臨床研究表明復方苦參注射液治療宮頸癌療效尤為顯著[8-9]。中藥研究發現苦參、白土苓具有涼血解毒、抗癌、提高免疫力等功效，苦參和土茯苓的中藥制劑已被中國中醫藥管理局批準用于臨床輔助治療各種癌癥[10-12]。目前復方苦參注射液治療宮頸癌的研究主要以臨床為主，對其藥理研究相對較少，其作用于宮頸癌機制的相關動物實驗和細胞實驗更少。

本研究利用網絡藥理學和分子對接的方法研究復方苦參注射液治療宮頸癌中化合物、作用靶標和作用機制。

1 資料及方法

1.1 復方苦參注射液化合物與相應靶標的收集

通過中藥系統藥理學數據庫平臺(TCMSP）[13]、中醫藥綜合數據庫(TCMID)[14]和中醫藥整合藥理學研究平臺(TCMIP）[15]，以復方苦參注射液全方藥物“苦參”、“土茯苓”為關鍵詞在“Herb name”條目中檢索其化合物，根據藥物化合物ADME的分子動力參數，將藥物篩選閾值設定為口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%，藥物相似性(drug-likeness，DL)≥0.18，獲得復方苦參注射液的有效化合物分子，同時在平臺獲得其對應的候選靶標。

1.2 宮頸癌GEO芯片熱圖與火山圖繪制從GEO數據庫[16]獲取GSE63514芯片與相關數據，使用R軟件，設定P＜0.005 and|log2(fold change)|＞1，制作火山圖與熱圖，收集疾病的差異基因。

1.3 靶蛋白互相作用網絡圖構建將復方苦參注射液與宮頸癌的差異基因取交集后,檢索String數據庫[17]，獲得蛋白互作關系，以“TSV”格式導出結果。通過Cytoscape3.7.2軟件對蛋白互作關系進行可視化處理，NetworkAnalysis實施網絡拓撲分析，分別以每個節點為中心計算相應的Degree值(連接度)，圖示化相互作用關系網絡(protein protein interaction,PPI)，并以PNG格式導出。

1.4 化合物-作用靶標網絡構建與分析去除重復及與化合物沒有交集的靶點，將與治療宮頸癌潛在作用靶點相對應的化合物分子構建關系數據表作為Cytoscape3.7.2軟件輸入的源文件，圖示化展現藥物活性成分與作用宮頸癌靶標之間的相互關系。

1.5 生物學過程及通路分析通過bioconductor里所包含的clusterprofiler程序包去富集分析復方苦參注射液作用于宮頸癌的靶標基因，設置P≤0.05，再通過pathview對所獲得的分子功能(molecular functions，MF)、生物過程(biologicalprocess，BP)、細胞組分(cellular components,CC)、及KEGG通路數據進行可視化，繪制與之對應的前30條數據的高級氣泡圖。

1.6 分子對接在PDB蛋白質數據庫[18]獲取復方苦參注射液重要化合物結合的候選蛋白質的晶體結構，利用MOE插件structure prepare進行修飾，去除配體、添加氫、去除水、優化和修補氨基酸，最小化所有候選靶點的能量。

2 結果

2.1 復方苦參注射液化合物及靶標篩選收集苦參和土茯苓化合物共178個，對應的靶標共1 136個。

2.2 宮頸癌GEO芯片熱圖與火山圖繪制獲取的128個樣本，運用R軟件來制作火山圖與熱圖，再利用excel匯總疾病的差異基因。紅色代表相應基因表達上調，綠色代表相應基因表達下調，顏色越深則表示基因表達的差異性越大，圖1,圖2。復方苦參注射液靶標基因與宮頸癌GEO差異基因的交集基因共118個，為復方苦參注射液對宮頸癌的潛在作用靶標。

圖1 正常人與宮頸癌患者差異基因熱圖

圖2 正常人與宮頸癌患者差異基因火山圖

2.3 靶蛋白互作網絡圖圖3中共包括112個節點，1 396條邊，節點尺寸越大，顏色越深表示相應節點的Degree越大，通過靶蛋白互作網絡圖計算得出相關節點度數的平均值為13，根據中值原則選取degree＞13的靶點（共計41個）作為重點研究，如VEGFA、MAPK3、CDK1、CCND1、MMP9、CDK4、CCNB1、CCNA2、HRAS、CXCL8、CHEK1、TOP2等。

圖3 靶蛋白互作網絡圖

2.4 藥物-化合物網絡構建將復方苦參注射液化合物和與宮頸癌的作用靶標繪制成藥物-化合物-靶點-疾病網絡圖。圖中節點共計296個，其中化合物分子178個，潛在作用靶點118個，邊線共計1 143條。復方苦參注射液主要通過多成分對應多靶標來發揮對宮頸癌治療作用，圖4。

圖4 藥物-化合物-靶點-疾病網絡圖

2.5 GO富集分析和KEGG富集分析GO富集分析結果顯示，BP分析富集基因數量較大的有不飽和脂肪酸代謝過程(unsaturated fatty acid metabolic process),對酸性化學物質的反應(response to acid chemical),膠原分解代謝過程(collagen catabolic process)等，點越大富集基因越多，P值越小顏色越紅，則表示相應結果的置信度越高，圖5。KEGG通路富集結果共計有共135條通路(P＜0.05)，如細胞周期信號通路(Cell cycle)、AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、乙型肝炎信號通路(Hepatitis B)等，通路節點越大，表示富集該通路基因數量越多，顏色越深則表示P值越小，圖6。

圖5 BP分析

圖6 KEGG富集圖

2.6 分子對接測試苦參堿和以下潛在靶蛋白（圖7）:CDK1（PDB:6gu2）、MMP9（PDB:6esm）之間的對接精度?？鄥A是復方苦參注射液的主要化合物之一，目前有大量的關于苦參堿治療宮頸癌的研究[19-21]。這些靶蛋白在PPI網絡圖中處于關鍵位置，同時它們參與了關鍵通路，提示它們宮頸癌對化合物的反應中可能起關鍵作用。對接分析結果顯示靶標蛋白和化合物分子之間結合性不錯。

圖7 苦參堿(MOL005944)與CDK1、MMP9的分子對接

3 討論

本研究結果表明，復方苦參注射液的有效活性化合物分子共有178個，其治療宮頸癌的靶標蛋白有118個，利用R軟件對這些靶標蛋白進一步分析獲得復方苦參注射液治療宮頸癌的生物過程及富集通路，從而探究復方苦參注射液對宮頸癌治療作用機制，為其治療宮頸癌提供理論依據，更加科學的指導臨床應用，也為進一步的實驗探究提供方向。

已有臨床數據驗證復方苦參注射液中的主要活性成分苦參堿對宮頸癌治療有顯著療效。其中程熠[22]等的體外實驗表明苦參堿可能通過誘導細胞凋亡、阻斷細胞周期進程來抑制宮頸癌HeLa細胞增殖。之前的很多研究結果表明苦參堿抑制宮頸癌SiHa細胞的活力和遷移能力[23-25]。王芳[26]報道苦參堿對宮頸癌C33A細胞增殖具有抑制作用并可以誘導其凋亡。王英[27]等的小鼠實驗結果表明苦參堿能增強順鉑抑制U14細胞增殖作用。李軍[28]等的實驗結果提示苦參堿通過抑制人子宮內膜癌Ishikawa細胞增殖，可以使癌細胞周期滯留在G0/G1，S期細胞數減少。此外，大量的研究表明苦參堿通過抗炎、抗菌、抗病毒等作用發揮其對宮頸癌發生發展的預防作用。

根據“靶蛋白互作網絡圖”以及文獻資料分析可得，復方苦參注射液可能通過作用血管內皮生長因子A(VEGFA)、細胞周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)、細胞周期蛋白D1(CCND1)、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)等4個靶標對宮頸癌發揮治療作用。VEGFA是由VEGFA基因編碼的蛋白質，對內皮細胞發揮作用，可增加血管通透性，誘導血管生成，血管發生和內皮細胞生長，促進細胞遷移和抑制細胞凋亡。Ioana[29]等的臨床實驗發現宮頸癌手術后復發的患者血清VEGFA顯著升高，提示VEGFA與宮頸癌發病密切相關，同時可預測宮頸癌放療效果。CDK是細胞周期調控的核心物質，CDK1是CDK的一種，其在分裂間期活性高，分裂期活性迅速下降，以順利完成分裂。Deng[30]等的Sp1可能通過靶向CDK1抑制G2/M期阻滯而參與宮頸癌放療治療，提示Sp1、CDK1有望成為提高宮頸癌放療療效的潛在治療靶點。大量的研究表明CCND1和腫瘤發生發展關系密切，其機制是CCND1基因末端的polyA尾的過度表達會導致細胞G1期縮短，進而體積縮小，分裂原的依賴性減弱，促進細胞周期與細胞增殖。Akin[31]等的細胞實驗結果表明依維莫司、吉西他濱和紫杉醇可降低宮頸癌CCND1的表達，提示CCND1是宮頸癌治療的關鍵靶點。MMP-9可降解細胞外基質,在腫瘤細胞生長,分化,侵襲,轉移，調節腫瘤血管生成及免疫監視中起到重要作用，與多種腫瘤的發生和發展密切相關。張瑞敏[32]等的臨床觀察結果表明宮頸癌患者血清MMP9水平均明顯升高,且與患者的臨床分期、分化程度、浸潤深度及淋巴結轉移情況有關。

文獻檢索結合KEGG通路富集分析表明,復方苦參注射液治療宮頸癌主要涉及磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)，P38絲裂原活化蛋白激酶(P38MAPK),核轉錄因子(NF-kappa B)，低氧誘導因子-1(HIF-1)。陸蓉[33]等的動物實驗提示苦參堿可能是通過抑制PI3K/AKT信號轉導通路來抑制HeLa細胞在機體內生長達到治療作用。王博[34]等的細胞實驗發現漢黃岑素可以通過調節P53信號通路增強宮頸癌細胞的自噬和凋亡，抑制其增殖,實現增強宮頸癌對順鉑的化療敏感性，且在一定劑量范圍內呈劑量依賴性。洪丹丹[35]等的細胞實驗結果驗證了小檗堿可以通過對TLR4-NF-κB信號通路調控來影響Bcl-2的表達,對于宮頸癌Hela細胞的增殖和遷移，促進其凋亡具有顯著的抑制作用，證明了小檗堿對治療宮頸癌有一定的作用。

4 小結

總之，本研究發現復方苦參注射液治療宮頸癌的主要化合物有苦參堿、槐定堿、右旋異苦參堿、贗靛葉堿、苦參醇、降苦參醇等，這些化合物通過作用于OPN、MMP-9、SIRT1、VEGFR-3等靶標以及調節PI3K-Akt、apelin/APJ、P38MAPK、NF-kB、AMPK等信號通路發揮對宮頸癌的治療作用。這表明復方苦參注射液治療宮頸癌具有多成分、多靶點、多通路參與的特點。本研究的不足之處在于未能通過科學實驗證實其他治療宮頸癌的可能機制，但可以為有關實驗的深一步進行提供思路與方向。