非酒精性脂肪肝轉歸肝硬化患者血清瘦素及受體基因表達特征研究

馬艷芹，謝永鵬，梁旭陽，倪立顯，徐 靜，左晨艷，呂勝祥

連云港市第一人民醫院 消化內科，江蘇 連云港 222020

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)具有可逆性，預后一般良好，但一些慢性脂肪肝(包括NAFLD)患者因脂肪肝引發肝損傷，甚至發展為具有不可逆性的嚴重疾病，如肝硬化或肝癌[1-2]。人體內，瘦素通過與Ghrelin激素(饑餓荷爾蒙)相互抵抗并作用于下丘腦弓狀核中的受體以抑制饑餓，刺激飽腹感，平衡能量[3-4]。另有研究表明，瘦素也在其他生理過程(如免疫和炎癥反應)中發揮作用[5-6]。本研究旨在探討NAFLD轉歸肝硬化患者瘦素與其受體水平的變化。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取連云港市第一人民醫院自2017年4月至2019年3月收治的125例NAFLD患者為研究對象。納入標準：符合脂肪肝的診斷標準；無飲酒史或每周飲酒量<40 g；血清轉氨酶>40 U/L，其中，以丙氨酸氨基轉移酶升高為主；影像學和組織學檢查符合NAFLD典型表現；可伴有肥胖、血糖和血脂水平異常或高血壓等代謝綜合征。排除標準：病毒性肝炎、藥物性肝病、自身免疫性肝病和各種其他肝病者；免疫功能障礙者；其他臟器嚴重疾病者。按照患者轉歸情況將患者分為A組(未轉歸為肝硬化；n=50)和B組(轉歸為肝硬化；n=75)。A組中，男性31例，女性19例；平均年齡(53.26±15.72)歲。B組中，男性49例，女性26例；平均年齡(54.18±14.75)歲；肝硬化代償期46例，失償期29例。兩組患者的性別、年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法 采集患者清晨空腹外周靜脈血5 ml，低溫離心后棄沉淀，將上清于-20℃保存待測。血清瘦素采取免疫放射法檢測，使用Linco公司相關試劑，并按說明書操作。采取酶聯免疫吸附法檢測血清可溶性瘦素受體(soluble leptinR，sOb-R)，檢測使用R&D Systems試劑盒，操作按說明書進行。血清瘦素受體(Ob gene receptor，Ob-R)基因表達情況以逆轉錄PCR實驗表征。活檢時獲取患者肝組織樣品(1.5 cm×1.5 cm×0.2 cm)，使用RNA抽提試劑盒(PureLink，Thermo Fisher，USA)提取細胞總RNA，以cDNA合成試劑盒合成的第一鏈作為模板進行逆轉錄，使用FastQuant RT試劑盒(KR106，TIANGEN，北京)和瓊脂糖凝膠電泳檢測Ob-R mRNA表達情況。相對表達量檢測使用凝膠成像系統(SYSTEM GelDoc XR，Bio-Rad)檢測。使用全自動生化分析儀(AU5800，Beckman)檢測患者空腹血糖(fasting blood-glucose，FBG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterin，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)。根據child-pugh分級將B組患者分為A、B、C 3級，A級預后相對較好，C級預后相對最差[7]。按照肝硬化分期將B組患者分為代償期與失償期。

2 結果

2.1 兩組患者血清瘦素及sOb-R水平比較 B組患者血清瘦素水平為(11.38±3.47)μg/L，高于A組的(8.55±2.06)μg/L，差異有統計學意義(P<0.05)。B組患者血清sOb-R水平為(16.23±4.11)μg/L，低于A組的(18.52±4.26)μg/L，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 B組不同肝硬化分期患者血清瘦素及sOb-R水平比較 失償期患者血清瘦素水平為(12.85±3.52)μg/L，高于代償期的(9.40±2.84)μg/L，差異有統計學意義(P<0.05)。失償期患者血清sOb-R水平為(16.72±3.97)μg/L，低于代償期的(19.01±3.05)μg/L，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 B組不同child-pugh分級患者血清瘦素及sOb-R水平比較 child-pugh分級C級患者血清瘦素水平高于A級、B級，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 B組不同child-pugh分級患者血清瘦素及sOb-R水平比較

2.4 兩組患者肝組織Ob-R mRNA表達情況比較 A組Ob-R mRNA的相對表達量為(122.75±15.28)，明顯高于B組的(107.13±14.32)，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 兩組肝組織Ob-R mRNA表達情況

2.5 兩組患者血液學指標比較 B組患者FBG明顯高于A組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組患者血液學指標比較

3 討論

本研究結果顯示，NAFLD發展為肝硬化患者的血清各指標水平明顯異于預后較為良好患者，其中，瘦素水平異常升高，sOb-R水平異常降低。本研究利用逆轉錄PCR檢查了Ob-R mRNA的表達情況，結果顯示，發展為肝硬化患者體內Ob-R基因表達明顯低于預后較為良好患者，與Long等[8]研究結果一致。有研究表明，在NAFLD疾病進展中，TG早期在肝細胞中積累為微泡，后逐漸增加聚為大泡狀，這一過程會對細胞造成物理損傷，并增加由于脂肪過多引起的炎癥反應，從而導致肝炎和肝纖維化[9-10]。而肥胖個體通常表現出比正常體質量個體更高的瘦素循環濃度，因此，血清瘦素升高可提示肝受損傷的程度[11]。此外，sOb-R在血清中水平降低可能是對瘦素水平異常升高的負反饋，以減少瘦素與受體的結合，從而維持代謝控制[12]。有研究報道，sOb-R經酶水解在膜外功能區脫落而進入循環，因此，sOb-R可反映Ob-R表達情況[13]，與本研究結果一致，但具體分子機制仍需進下一步的驗證。

本研究分析了NAFLD發展為肝硬化的不同臨床分期及不同分級標準患者的瘦素、sOb-R水平，隨著疾病嚴重程度增加，患者血清瘦素水平升高，而sOb-R水平降低。這提示，瘦素和sOb-R水平隨著NAFLD嚴重程度(或疾病發展)而變化，血清瘦素及Ob-R表達情況可以作為NAFLD是否發展為肝硬化和表征NAFLD疾病發展的指標。NAFLD與葡萄糖和脂質代謝異常有關，包括胰島素抵抗內源性葡萄糖產生，葡萄糖處置率和脂肪組織中的抗脂肪分解[14-15]。本研究發現，B組患者FBG明顯高于A組，與上述研究結果一致。本研究存在一定的不足：本研究因為時間和病例樣本限制(活檢肝組織樣本體積較小)，未將Ob-R mRNA樣本根據臨床分期和分級進行細分，因此，未顯示不同時期和分期患者mRNA表達情況。下一步將擬納入大量預后不良且擬行肝移植或部分切除手術的患者，獲取大于本研究樣本量的肝組織，根據上述分類進行再研究和分析，獲取較為可靠的分級結果。

綜上所述，NAFLD轉歸為肝硬化相較于預后良好的患者血清瘦素水平異常增高，sOb-R水平異常降低，同時伴隨FBG水平變化。