肺炎支原體肺炎患兒外周血白細胞自噬相關蛋白表達及臨床意義*

侯雪 劉燕 楊曉麗 李靜

(1.山西醫科大學兒科醫學系小兒內科教研室,山西 太原 030001； 2.山西省人民醫院兒科,山西 太原 030012)

肺炎支原體(Mycoplasma Pneumoniae，MP)是引起兒童社區獲得性肺炎(Community Acquired Pneumonia，CAP)的最常見病原體之一。近年來引起重癥及難治性肺炎支原體肺炎病例(Refractory Mycoplasma Pneumoniae Pneumonia,RMPP)報道逐漸增多，故了解MP引起的肺炎支原體肺炎(Mycoplasma Pneumoniae Pneumonia，MPP)的發病機制越來越迫切。目前關于MPP致病的具體機制仍不明確，主要包括上皮黏附、毒素作用及免疫紊亂[1]。自噬是機體的一種穩態機制，通過溶酶體降解途徑處理受損的細胞器、變性蛋白質以及侵入的病原體，是近些年發現具有防御病原菌的天然免疫和獲得性免疫的新途徑[2]。關于自噬與肺部感染性疾病如金黃色葡萄球菌、新型隱球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)和結核分枝桿菌感染[3-6]的一些體外和動物實驗表明，自噬在肺部感染性疾病中具有十分重要的作用，但目前國內外尚缺乏自噬在MPP患兒外周血中的研究，且有關MPP患兒外周血白細胞自噬水平的研究國內外仍然缺乏。本研究通過檢測MPP患兒外周血白細胞自噬相關蛋白LC3II/I比例、Beclin1表達量及細胞因子的表達量，分析自噬與細胞因子和不同程度MP的相關性，探討自噬在MPP中所發揮的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月～2020年5月山西省人民醫院兒科病房收治的MPP患兒進行前瞻性分析。MPP感染急性期患兒50例，所有患兒診斷標準符合《諸福棠實用兒科學》MPP感染診斷標準[8]。依照病情將50例MPP患兒分為輕癥組及重癥組。重癥組納入標準[8]：在確診MPP基礎上出現以下任意一條表現：①明顯氣促或心動過速(根據不同年齡有不同評判標準)，伴或不伴呼吸困難(鼻翼搧動、呻吟、三凹征)及紫紺等。②低氧血癥，吸入空氣條件下，脈搏血氧飽和度(SaO2)≤0.92。③經大環內酯類抗菌藥物正規治療7 d及以上，臨床征象加重、仍持續發熱、肺部影像學加重。④胸部影像學表現為多葉段受累或受累面積≥2/3肺。⑤出現胸腔積液、肺不張、肺膿腫等肺內并發癥。⑥合并其他系統嚴重損害(中樞神經系統感染、心力衰竭、心肌炎、消化道出血、明顯電解質/酸堿平衡紊亂等)。家長自愿參與研究，簽署同意書。排除其他疾病所致肺炎、嚴重器質性疾病、糖皮質激素或抗生素及免疫抑制劑服藥史等患兒。其中輕癥組28例，重癥組22例。選取該院同期門診體檢的兒童在排除肺炎支原體近遠期感染后認定為健康兒童25例為對照組。入選標準:①年齡1～12歲,性別不限。②近1月內無咳嗽、發熱鼻塞、流涕等急性呼吸道癥狀,無嘔吐、腹瀉等消化道癥狀者。③無免疫缺陷性疾病，排除慢性疾病者。④患兒依從性好，能配合檢查。本研究獲得山西省人民醫院倫理委員會批準，患兒監護人知情同意。

MPP輕癥組28例，年齡3～12歲，平均(6.12±2.32)歲；重癥組22例，年齡3～12歲，平均(7.06±1.91)歲；對照組25例，年齡3～12歲，平均(6.42±2.46)歲。3組受試對象性別、年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 材料與方法

1.2.1 主要試劑及設備 LC3Ⅱ/I、 Beclin1的一抗及二抗(北京百奧菜博科科技有限公司)；白細胞介素6( Interleukin6，IL-6)、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis Factor-α，TNF-α)、酶聯免疫吸附( Enzyme Linked Immune Sorbent Assay，ELISA)試劑盒(伊來瑞特)；二喹啉甲酸蛋白檢測試劑盒、增強型化學發光底物( Thermo Fisher公司，美國)。

1.2.2 標本采集及檢測 輕癥組、重癥組在確診時靜脈抽取2 mL非抗凝靜脈血，對照組則在清晨空腹抽取2 mL非抗凝靜脈血，分離血清，置-20℃冰箱保存待測，標本采集前兩周患兒無激素和免疫調節劑治療史。其中1 mL檢測細胞因子，1 mL分離并裂解白細胞檢測 LC3Ⅱ、LC3I和 Bec1in1表達量,計算 LC3Ⅱ/I比例。 每組設置 3 個復孔,試驗均重復 3 次取平均值。采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測患兒血清TNF-a、IL-6濃度，試驗均重復3次取平均值。

1.3 統計學分析 數據采用SPSS 20.0統計軟件進行分析，組間比較采用t檢驗；采用 Pearson相關性分析比較自噬水平和細胞因子之間的相關性。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外周血細胞LC3II/I比例及Beclin1表達量 MPP輕癥組、重癥組外周血白細胞中自噬相關蛋白LC3II/I及Beclin1表達量高于對照組，MPP重癥組高于輕癥組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1～2。

圖1 3組白細胞中自噬相關蛋白LC3II/I表達情況

圖2 3組白細胞中自噬相關蛋白Beclin1表達情況

2.2 血清細胞因子IL-6、TNF-α水平表達量 MPP輕癥組、重癥組IL-6、TNF-α水平高于對照組，MPP重癥組IL-6、TNF-α水平高于輕癥組，差異有統計學意義(均P<0.05)，見圖3。

圖3 3組外周血白細胞血清細胞因子表達水平

2.3 LC3II/I、 Beclin1及細胞因子的相關性 自噬相關蛋白LC3II/I、 Beclin1表達與IL-6、TNF-α成正相關(均P<0.05)，見表1。

表1 肺炎支原體患兒白細胞自噬相關蛋白和炎癥指標的相關性

3 討論

MP感染在兒童肺炎中占比約為20%～40%，且主要集中于5～9歲的群體，近年來MPP發病率逐漸上升[9]，重癥肺炎支原體肺炎(Severe Mycoplasma Pneumoniae Pneumonia，SMPP)和RMPP在國內呈逐年升高的趨勢，SMPP不僅可引起肺部實變、肺不張、胸腔積液、氣胸等肺內并發癥，還可導致多系統肺外并發癥，病程長，病情重，甚至可引起多器官功能障礙綜合征(Multiple Organ Dysfunction Syndrome，MODS)或多器官功能衰竭 (Multiple Organ Failure，MOF)，甚至死亡[10]。因此，臨床對肺炎支原體病原學及免疫機制的研究也逐漸深入。迄今為止，MPP的發病機制尚不明確，隨著研究的深入，目前已有免疫學發病機制、呼吸道上皮細胞吸附和MP直接侵入學說[1，11]。因此，研究MPP的發生發展機制是及時治療MPP和降低SMPP患病率的關鍵。

自噬是真核細胞生物體在不斷進化過程中形成的一個高度保守的過程，其參與多種生物學過程，自噬功能的改變影響老化和有缺陷的細胞器、蛋白聚集體以及入侵病原體的清除，它既能對抗外來病原微生物的入侵，又能保護細胞免受內毒物的損害[12]。有研究發現，自噬與很多疾病的發生密切相關，如神經退行性疾病、心血管疾病、克羅恩病、腫瘤及感染性疾病等[13-14]。一些動物實驗表明，綿羊肺炎支原體(Mycoplasma Ovipneumoniae，MO)感染早期可通路激活巨噬細胞自噬，隨著感染時間的延長，可通過調節PI3K通路抑制巨噬細胞的凋亡，利于MO在胞內的存活，利于避免被其它免疫細胞識別、清除[15]。MP可誘導炎癥的發生，同時一些細胞內應激物也會誘導自噬的發生。自噬對胞內應激物的清除可以影響炎性小體裝配，繼而影響到炎癥水平[16]。

自噬是由多種自噬相關基因 (Autophagy Related Gene, ATG)和受體信號分子通路調控的免疫過程[17]。Beclin-1和LC3作為自噬的標志性蛋白[18]，是實驗中檢測自噬作用最常用的蛋白，Beclin-1是最早被發現的多功能自噬蛋白之一，它可調節自噬性細胞死亡途徑，與自噬體形成密切相關，對促進不同蛋白質之間相互作用起重要作用[19]。LC3是涉及自噬體形成的泛素樣蛋白質, 它與酵母Atg8蛋白同源。LC3II定位于參與自噬途徑的細胞膜上，其數量與自噬體形成程度相關，是很好的自噬體標記物[20]。在哺乳動物的自噬誘導時，磷脂酰乙醇胺(PE)修飾LC3-I轉化為LC3-II是自噬體形成的關鍵步驟[21]。LC3II/I比例與自噬泡的數量成正相關，某種程度上反應細胞的自噬活性，比值越高，自噬活性越高[22]。本研究中細胞中LC3II/I、Beclin1表達均高于對照組，提示MPP患兒中性粒細胞中發生了自噬反應。

目前許多研究表明，多種細胞因子參與了MPP炎癥反應過程，TNF-α、IL-6等細胞因子是調節細胞凋亡的重要細胞因子，若細胞因子在血清中表達出現失控，可直接導致細胞凋亡[9]。本研究中輕癥組、重癥組患兒血清中IL-6、TNF-α均高于對照組，表示IL-6、TNF-α參與了MPP炎癥反應發生的過程，重癥組患兒血清中IL-6、TNF-α高于輕癥組，證明患兒病情越重，則血清中IL-6、TNF-α的含量越高，病情與炎癥因子水平呈正相關，結合臨床可作為MPP嚴重程度的指標及病情發展的參考。自噬在調節炎癥介質中具有重要作用，并能夠影響細胞中細胞因子的產生[23]，而在失調控的免疫反應中,大量的促炎因子和聚集的白細胞可以通過炎癥信號通路誘導組織細胞內出現內質網應激,線粒體損傷,活性氧過量生成,誘發保護性自噬反應以包裹損傷的細胞器,限制損傷信號的進一步擴散。自噬被認為是機體調節免疫及對抗應激的重要防線。MPP發病重要機制之一是支原體脂蛋白誘導細胞凋亡，直接誘導細胞凋亡機制不明，間接誘導細胞凋亡是通過分泌相關細胞因子：TNF-α、IL-1、IL-6等發揮作用。若細胞因子在血清中的表達失控，則可直接引起細胞凋亡，而細胞凋亡與細胞自噬關系密切。

本研究中重癥組自噬蛋白水平高于輕癥組，表明自噬和病情程度有關，病情越重，自噬程度越高。同時IL-6、TNF-α與自噬蛋白成正相關，考慮可能是MPP中發生自噬會影響細胞因子的改變從而影響病情的輕重程度。推測通過測定自噬在不同程度MPP肺炎中的水平可對MPP的病情嚴重程度及預后做出評估。

4 結論

本研究結果顯示，MPP患兒外周血白細胞自噬蛋白、炎癥因子顯著增加，提示自噬參與MPP的發病過程，細胞因子水平越高，炎癥反應越明顯，且自噬和細胞因子呈正相關，可能與MPP中發生自噬影響細胞因子的改變從而影響病情有關。目前，MPP細胞自噬處于基礎研究階段，自噬體和肺炎支原體互相作用的具體分子機制還有待進一步研究，今后仍需大量的基礎和臨床試驗進行驗證。