刺猬信號基因HHIP啟動子區(qū)甲基化與漢族老年骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)性*

卓婭·買買提烏斯?jié)M 塔吉古麗·木沙 王紅梅

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院干部保健二科，新疆 烏魯木齊 830002)

老年性骨質(zhì)疏松癥(Senile Osteoporosis，SOP)是常見的骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis,OP)類型[1]，因破骨細(xì)胞增加，骨吸收或/和成骨細(xì)胞減少骨形成導(dǎo)致不平衡的骨代謝-重建。刺猬(Hh)信號通路是一組調(diào)控胚胎形成、器官發(fā)生、成年干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、組織維持并參與各種腫瘤的病因?qū)W信號；此信號中配體Hh與受體SMO結(jié)合減輕了PTCH1的抑制并上調(diào)了Gli1/2蛋白。另外，人類刺猬蛋白配體Hh可與HHIP蛋白相互作用，從而對Hh信號進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)[2]，與間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)的成骨分化密切相關(guān)[3-6]。DNA甲基化的研究已廣泛應(yīng)用于包括OP在內(nèi)的多種疾病中[7-9]。HHIP基因可參與軟骨內(nèi)骨形成[10]。而HHIP的甲基化已被發(fā)現(xiàn)也可以在腫瘤中調(diào)節(jié)刺猬信號通路[11]。然而，HHIP在骨質(zhì)疏松癥中的甲基化狀態(tài)以及與疾病的關(guān)系仍不清楚。本研究首先探討SOP患者外周血中刺猬信號分子的表達(dá)變化，并進(jìn)一步通過探討HHIP的甲基化與SOP患者血鈣和骨代謝標(biāo)志物表達(dá)的關(guān)系，分析刺猬信號參與調(diào)控骨質(zhì)疏松癥的作用和機制，旨在為骨質(zhì)疏松的發(fā)生機制和靶向治療提供新的實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年7月～2019年7月我院收治的102例漢族老年SOP患者為觀察組，并選取同期于我院體檢中心體檢的100例漢族老年健康者為對照組。記錄研究對象的性別、年齡、身高、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)一般資料。 納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者診斷與中國人OP診斷標(biāo)準(zhǔn)專家共識(2014版)相符，骨量峰值低于2個標(biāo)準(zhǔn)差。②90 d內(nèi)未服用影響骨代謝的激素或其他藥物[12]。排除標(biāo)準(zhǔn)：①SOP患者同時患有如糖尿病、甲狀腺機能亢進(jìn)、甲狀旁腺功能亢進(jìn)等疾病。②惡性腫瘤患者。③患有慢性胃炎、腸炎、佩吉特氏病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及強直性脊柱炎者。④肝腎功能異常者。⑤12個月內(nèi)出現(xiàn)意外導(dǎo)致運動障礙者。本研究經(jīng)過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會認(rèn)定符合醫(yī)學(xué)倫理，并與所有參與者及家屬簽署了知情同意書。

1.2 試劑與耗材 I型前膠原氨基端肽(P1NP)和β-骨原交聯(lián)(β-CrossLaps)ELISA試劑盒購于上海江萊生物科技有限公司。血Ca2+檢測試劑盒購于中國中生北控生物科技有限公司。EDTA抗凝采血管(貨號367525)購于美國BD公司；Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(貨號AS1114546)購于挪威Axis-Shield公司。RPIM-1640培養(yǎng)基(貨號SH30809.01B)購于美國Hyclone公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(DBI-2220)購于上海凱學(xué)生物科技有限公司；熒光定量PCR試劑盒(AOPR-1200)購于美國Genecopies。

1.3 P1NP、β-CrossLaps及血Ca2+水平檢測 空腹抽取所試對象早晨靜脈血2 mL，按照廠家說明，采用美國Bio-Rad酶聯(lián)免疫分析法檢測P1NP和β-CrossLaps的水平。使用美國羅氏公司Cobas 8000酶標(biāo)儀并嚴(yán)格按照血Ca2+試劑盒提供的說明書檢測對照組和觀察組的血Ca2+。

1.4 外周血單個核細(xì)胞分離 收集抗凝外周血，利用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心分離外周血細(xì)胞。將外周血離心后，在離白細(xì)胞層約5 mm處停止血漿吸取。用無菌移液管向剩余標(biāo)本中加入等體積的RPIM-1640培養(yǎng)基稀釋，反復(fù)倒置混合。用無菌的移液管稀釋上述標(biāo)本，加入含有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中。室溫下，在2200 rpm的離心機中離心20 min。離心完成后棄去上清，離心管中收集外周血單核細(xì)胞，加入RPIM-1640培養(yǎng)基混勻，計數(shù)細(xì)胞。將剩余的細(xì)胞離心冷凍存儲。

1.5 熒光定量PCR檢測外周血單個核細(xì)胞SHH、PTCH1、SMO、Gli、HHIP的mRNA表達(dá) 使用Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，使用磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-Phosphate Dehydrogenase，GAPDH)作為熒光定量PCR檢測基因表達(dá)的內(nèi)參基因，進(jìn)行熒光定量PCR檢測。SHH、PTCH1、SMO、Gli、HHIP基因的熒光定量PCR引物，見表1。PCR反應(yīng)條件95 ℃預(yù)變性8 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火22 s，72 ℃延伸34 s，共42個循環(huán)。每個樣本重復(fù)檢測3次。使用2-△△Ct表示mRNA相對表達(dá)量。

表1 Hedgehog通路相關(guān)基因引物序列

1.6 外周血單個核細(xì)胞HHIP啟動子區(qū)甲基化檢測 采用蛋白酶k -酚/氯仿法提取兩組單核細(xì)胞基因組DNA，用紫外分光光度計D(260)/D(280)分析DNA的純度。利用甲基化敏感酶和甲基化依賴酶消化法檢測HHIP基因啟動子區(qū)甲基化，結(jié)合RTqPCR法分析P16。用甲基化敏感酶HhaI和甲基化依賴酶McrBC對各組DNA樣品進(jìn)行酶切，以非酶消化樣品為對照。甲基化敏感酶HhaI特異性識別和切割非甲基化CGCG位點，甲基化依賴性酶McrBC特異性識別和切割PumCG(N40-3000)位點。體系為：2 μL限制性酶，10×NEB緩沖液3.0 μL，1 mmol/l GTP，BSA 100 μg/mL，DNA 2 μg，去離子水稀釋至20 μL，37 ℃消化16 h，65 ℃滅活20 min。

首先設(shè)計目標(biāo)基因CpG區(qū)擴(kuò)增的引物，在HHIP基因CpG島區(qū)域，擴(kuò)增區(qū)域同時包含甲基化敏感酶和甲基化依賴酶切位點。引物序列為:上游引物(HHIP-MF) 5′- TGCTGTCTCGCTTCTG-3′，下游引物(HHIP-MR) 5′-TGGCGTTCTCTTCGCTTG-3′，擴(kuò)增片段長度為183 bp。總RTqPCR反應(yīng)體系為15 mol/L：消化產(chǎn)物2 mol/L，HHIP-MF和HHIP-MR引物各1 mol/L，2倍PCR master mix 3.0 mol/L，dNTP 1 mol/L，去離子化的/l H2O 8 mol。反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min， 95 ℃ 25 s，60 ℃ 65 s， 43個循環(huán)。在72～100 ℃之間，每度取8個熒光采集點，繪制溶解曲線。結(jié)果判斷:如果使用DNA樣本和RTqPCR檢測特定片段的擴(kuò)增，但沒有放大McrBC消化后，然后判定樣品甲基化；如果沒有放大后鐵道Ⅰ消化和McrBC如果放大積極限制性內(nèi)切酶消化后，為未發(fā)生甲基化。Ct值≥35視為無放大。

1.7 DNA亞硫酸氫鹽修飾及測序 為驗證單核細(xì)胞基因組DNA的甲基化狀態(tài)，使用經(jīng)典的亞硫酸氫鹽處理和測序方法。檢測前用亞硫酸氫鈉處理DNA樣品，用Winzard DNA凈化樹脂試劑盒回收純化DNA。亞硫酸氫鹽測序引物序列為：上游引物HHIP 正義：GTGCGGATACATGAGTGCGTG，下游引物HHIP反義：CCCTACTATTACTCGCTTA，擴(kuò)增產(chǎn)物243 bp。總反應(yīng)體系為25 μL，含100 ng經(jīng)亞硫酸氫鈉處理的DNA，每個引物25 pmol/l，2×PCR混合12.5 μL，反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 m s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個周期；72℃ 5min，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離純化，然后送到上海測序。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較 兩組性別、年齡、身高等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 兩組一般資料比較

2.2 外周血單個核細(xì)胞中刺猬信號通路相關(guān)基因的表達(dá) 與對照組相比，觀察組刺猬信號通路相關(guān)基因SHH、PTCH1、SMO、Gli1、Gli2 mRNA在單個核細(xì)胞中下調(diào)(均P<0.05)，見圖1A～B。與對照組相比，HHIP的mRNA在觀察組單個核細(xì)胞中上調(diào)約4倍(P<0.01)，見圖1A、C。

圖1 骨質(zhì)疏松癥患者和健康者外周血單個核細(xì)胞中刺猬信號通路相關(guān)基因的mRNA水平

注:A. 蛋白印跡圖；B. SHH、PTCH1、SMO、Gli1、 Gli2的mRNA水平；C.HHIP的mRNA水平。與對照組比，①P<0.05

2.3HHIP基因啟動子區(qū)甲基化水平 甲基化實驗結(jié)果表明，觀察組外周血單個核細(xì)胞中HHIP基因啟動子區(qū)為低甲基化狀態(tài)。首先，對照組外周血單個核細(xì)胞基因組DNA經(jīng)HhaⅠ酶切后PCR擴(kuò)增陽性，(Ct值<30個循環(huán))，而經(jīng)McrBC酶切后無擴(kuò)增(Ct值>35個循環(huán))，HHIP基因啟動子區(qū)呈高甲基化狀態(tài)。其次，觀察組中外周血單個核細(xì)胞基因組DNA經(jīng)HhaⅠ酶切后PCR無擴(kuò)增(Ct值>35個循環(huán))，而經(jīng)McrBC酶切后擴(kuò)增陽性(Ct值<30個循環(huán))，兩組基因HHIP基因啟動子區(qū)CpG島甲基化水平分布圖，見圖2。觀察組基因HHIP啟動子區(qū)CpG島平均甲基化率為(11.36%±1.07%)，對照組平均甲基化率為(16.88%±0.92%)。與對照組比，觀察組HHIP基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化率下調(diào)(P=0.013)。

圖2 HHIP基因啟動子區(qū) CpG島甲基化水平分布圖

2.4 甲基化狀態(tài)的亞硫酸氫鹽測序驗證 將兩組外周血單核細(xì)胞基因組DNA用亞硫酸氫鹽修飾后，通過PCR擴(kuò)增HHIP基因的啟動子區(qū)域。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，兩組PCR產(chǎn)物的條帶均為243 bp，條帶長度與預(yù)期片段長度一致。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序后，將測序結(jié)果與HHIP基因啟動子區(qū)原始序列進(jìn)行比對。驗證結(jié)果中對照組HHIP基因啟動子區(qū)CpG位點發(fā)生甲基化而未被亞硫酸氫鹽所修飾。而觀察組HHIP基因啟動子區(qū)CpG位點呈低甲基化水平。

2.5HHIP基因甲基化與老年骨質(zhì)疏松癥相關(guān)性分析 觀察組血清PINP含量[(46.1±5.2)ng/mL]顯著高于對照組[(22.1±4.5)ng/mL](t=25.1，P=0.002)，見圖3A。與對照組[(0.57±0.08)]ng/mL]相比，觀察組血清β-CrossLaps[(1.08±0.21)ng/mL]含量升高(t=9.94，P=0.012)，見圖3B。與對照組[(3.12±0.23)mmol/L]相比，觀察組[(2.31±0.11)mmol/L]的血鈣含量下調(diào)(t=11.45,P=0.017)，見圖3C。

圖3 骨質(zhì)疏松癥患者和健康者血清PINP

觀察組患者外周血HHIP表達(dá)與其甲基化狀態(tài)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。且觀察組患者外周血HHIP甲基化水平與血清P1NP、血清β-CrossLaps呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)，見表3、圖4。

表3 HHIP的甲基化與血清P1NP和β-CrossLaps的相關(guān)性

圖4 HHIP的甲基化與血清P1NP和β-CrossLaps的相關(guān)性

3 討論

本研究觀察了102例漢族老年骨質(zhì)疏松癥中HHIP啟動子區(qū)的甲基化水平，發(fā)現(xiàn)老年骨質(zhì)疏松癥組的HHIP的甲基化水平普遍低于對照組，與HHIP的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，并且與骨吸收標(biāo)志物P1NP和β-CrossLaps負(fù)相關(guān)，這表明刺猬信號基因HHIP介導(dǎo)老年骨質(zhì)疏松癥。

除HHIP外，在觀察組中其余基因SHH、PTCH1、SMO、Gli1、Gli2表達(dá)均降低，因此推測低水平刺猬信號對老年性骨質(zhì)疏松發(fā)展可能有利。Runx2基因調(diào)節(jié)骨形成蛋白如骨鈣素OC、骨橋蛋白OPN、骨唾液蛋白BSP表達(dá)，Osx位于Runx2的下游，在成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞中均有表達(dá)，而Runx2和Osx兩者均可被刺猬信號正向調(diào)節(jié)，主要是促進(jìn)MSCs向成骨細(xì)胞分化[3]。Oliveira等[3]證實，在普通條件下培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可在刺猬信號通路激活劑紫癜素的刺激下分化為成骨細(xì)胞，與成骨細(xì)胞分化相關(guān)的基因如Runx2表達(dá)上調(diào)，但成骨抑制基因SMAD3的表達(dá)降低。另外，刺激信號通路中的Gli2蛋白促進(jìn)Runx2的表達(dá)，并誘導(dǎo)小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2分化為成骨細(xì)胞[13]。相反，抑制刺猬信號可抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。用環(huán)丙胺抑制刺猬信號可誘導(dǎo)斑馬魚胚胎骨化喪失，成骨細(xì)胞分化標(biāo)記物Runx2和Osx在軟骨膜中的表達(dá)降低，下調(diào)刺猬信號的下調(diào)抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化成成骨細(xì)胞[14-16]。本研究表明在SOP中，刺猬信號通路被抑制，從而Runx2對MSCs成骨分化的促進(jìn)作用被削弱。而且，刺猬信號通路的抑制很可能是與HHIP啟動子區(qū)甲基化降低導(dǎo)致的HHIP升高有關(guān)。

骨代謝是一個動態(tài)的生物過程，骨重塑在整個生命過程中都是活躍的，被復(fù)雜的調(diào)節(jié)系統(tǒng)調(diào)控。PINP由成骨細(xì)胞分泌，對Ⅰ型膠原代謝產(chǎn)物的形成非常重要，與骨形成有密切關(guān)系；β-CrossLaps是Ⅰ型膠原分解的產(chǎn)物，是骨吸收的關(guān)鍵指標(biāo)[17]。

本研究中PINP和β-CrossLaps的水平在觀察組中明顯增高，作為Hedgehog抑制因子，觀察組中HHIP的表達(dá)顯著升高，與其啟動子區(qū)甲基化水平負(fù)相關(guān)。研究表明，刺猬信號通路刺激破骨細(xì)胞代謝并調(diào)節(jié)凋亡[18-20]。與此一致的是，HHIP啟動子區(qū)甲基化與骨吸收標(biāo)志物P1NP和β-CrossLaps負(fù)相關(guān)，表明HHIP啟動子區(qū)甲基化參與調(diào)節(jié)老年性骨質(zhì)疏松癥中骨的代謝平衡。

本研究存在的缺陷：選取的102例漢族SOP患者與100例健康漢族人群進(jìn)行比較。因骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生、發(fā)展受多種復(fù)雜因素的影響，因此需要進(jìn)一步納入更大的樣本，從而分析HHIP甲基化與SOP的關(guān)系。另一方面，本研究是一項橫斷面研究，HHIP甲基化水平與SOP發(fā)生、發(fā)展的動態(tài)關(guān)系尚不清楚，需要更深入的研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，漢族老年骨質(zhì)疏松癥患者外周血單個核細(xì)胞中HHIP的啟動子區(qū)甲基化水平顯著降低，與血清P1NP和β-CrossLaps含量呈負(fù)相關(guān)。這表明，老年骨質(zhì)疏松癥患者外周血中基因甲基化水平很可能參與骨代謝和疾病發(fā)展，此研究結(jié)果為骨質(zhì)疏松癥的診斷和治療提供了潛在的新靶點。