骨肉瘤細胞外泌體調控JAK2/STAT3信號通路影響成纖維細胞向腫瘤相關成纖維細胞轉化*

折勝利 宋興華 周楊 何園 賈晶 劉彥博 王良華

(1.西北工業大學醫院骨科，陜西 西安 710012；2.新疆醫科大學第一附屬醫院骨病/骨腫瘤科，新疆 烏魯木齊 830054；3.陜西省新安中心醫院骨科，陜西 西安 710048；4.新疆醫科大學基礎醫學院，新疆 烏魯木齊 830011)

骨肉瘤是常見的骨原發性惡性腫瘤，多發病于青少年，表現為成骨細胞分化并產生惡性類骨質，具有易轉移、易復發、侵襲性高等特點，容易發生遠端轉移[1-2]。骨肉瘤的治療主要是根治性腫瘤切除和新輔助化療的結合，雖然新輔助化療能夠對骨肉瘤起到明顯的治療效果，但是治療后患者的生存率低于20%[3-5]，所以研究更多用于骨肉瘤治療的靶點對于其臨床治療至關重要。

外泌體是一類由多數活細胞分泌的納米級囊泡，粒徑約50～100 nm，內含多種RNA、蛋白質、脂質等物質，可隨體液轉移至靶組織和靶器官而發揮調控作用[6-7]。研究表明，腫瘤細胞分泌的外泌體可攜帶腫瘤細胞的遺傳物質，而調控腫瘤細胞的生長、轉移、血管新生、免疫逃逸等過程[8-10]。已有研究表明，肝癌細胞外泌體可調控腫瘤相關成纖維細胞的激活而促進腫瘤的轉移[9]，但骨肉瘤細胞外泌體是否具有此作用尚無明確報道。本研究通過骨肉瘤細胞外泌體對成纖維細胞轉化的影響，旨在為骨肉瘤的臨床治療和研究提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料 人骨肉瘤細胞U2-OS、MG-63，人成骨細胞hFoB1.19(中科院上海細胞庫)；人肺成纖維細胞MRC-5(普諾賽生物技術有限公司)；cDNA合成試劑盒、qRT-PCR試劑盒(福麥斯生物技術有限公司)，p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、GAPDH(武漢三鷹生物技術有限公司)，Transwell小室(福麥斯生物技術有限公司)，無外泌體胎牛血清(愛必信生物科技有限公司)。

1.2 細胞培養 U2-OS、MG-63、hFoB1.19細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，MRC-5細胞培養于含10%胎牛血清及1%非必需氨基酸的MEM培養基中，所有細胞均在37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱中培養至細胞匯合率達70%～80%時，使用胰蛋白酶溶液消化并傳代，取對數生長期的細胞進行后續研究。

1.3 外泌體的提取 差速離心法提取hFoB1.19、U2-OS、MG-63細胞外泌體，具體步驟為：將細胞接種至細胞培養皿中，用含10%無外泌體胎牛血清的DMEM培養基培養48 h后收集細胞培養上清，然后將上清液3000×g，4 ℃離心15 min；收集上清液6000×g離心40 min；收集上清液10000×g離心1 h，取上清；100000×g離心1 h，收集沉淀即為外泌體，用400 μL PBS重懸外泌體，并放在-80 ℃保存。

1.4 外泌體的鑒定 透射電鏡觀察外泌體的結構，主要步驟為：取透射電鏡專用的銅網，滴加20 μL外泌體溶液，使用紅外燈烘烤銅網10 min，繼續向銅網滴加2滴磷鎢酸，繼續使用紅外燈下烘烤10 min，用濾紙吸取多余的液體，在透射電鏡下拍照，并觀察外泌體的結構。

1.5 細胞增殖 將MRC-5細胞稀釋至50000個/mL，將上述細胞接種至96孔板，每孔100 μL，每組3個復孔，每孔加入外泌體，使外泌體終濃度為10 μg/mL，在培養箱中共孵育，分別于24、48、72 h取出對應的細胞培養板，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，于培養箱中孵育4 h后，使用酶標儀檢測各孔450 nm處的吸光度，OD值越大，細胞增殖能力越強。

1.6 細胞遷移 用DMEM空白培養基重懸MRC-5細胞，細胞接種至Transwell小室中，每孔1×104個細胞，體積為200 μL，每孔加入外泌體，使其終濃度為10 μg/mL，小室放置于24孔板，24孔板每孔加入600 μL DMEM完全培養基，然后將24孔板置于細胞培養箱中24 h，Transwell小室底部用結晶紫染色10 min，然后在顯微鏡下觀察并拍照，比較各組細胞遷移數。

1.7 細胞侵襲 用Transwell小室法檢測細胞侵襲能力，主要步驟為：取Matrigel膠融化后，20 μL平鋪于Transwell小室中，小室置于37 ℃培養箱中1 h，使Matrigel膠充分凝固，用DMEM空白培養基重懸MRC-5細胞，細胞接種至Transwell小室中，每孔1×104個細胞，體積為200 μL，每孔加入外泌體，使其終濃度為10 μg/mL，小室放置于24孔板，24孔板每孔加入600 μL DMEM完全培養基，然后將24孔板置于細胞培養箱中24 h，Transwell小室底部用結晶紫染色10 min，然后在顯微鏡下觀察并拍照，比較各組細胞侵襲數。

1.8 qRT-PCR 將MRC-5細胞接種于6孔板中，每孔加入外泌體，使其終濃度為10 μg/mL，共孵育24 h后，使用TRIzol試劑盒提取各組細胞的RNA，使用核酸定量儀定量后，根據cDNA試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，然后使用qRT-PCR試劑盒進行反應，以GAPDH為內參，使用2-△△CT法計算基因相對表達量。所用引物序列見表1。

表1 IL-1β、IL-6、 IL-8、GAPDH引物序列

1.9 Western blot 取與外泌體共孵育24 h后的MRC-5細胞1×107個消化于離心管中，使用RIPA蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，根據BCA蛋白定量試劑盒定量，然后進行SDS-PAGE凝膠電泳，每孔上樣量為10 μg，轉膜，用5%BSA封閉2 h，然后以1∶1000比例稀釋后的一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后二抗室溫孵育1.5 h，再用TBST洗膜后按照ECL試劑盒說明書配置發光液，并將PVDF膜浸入發光液中反應半分鐘，曝光并拍照，用Image J軟件對曝光結果進行定量分析。

2 結果

2.1 外泌體鑒定結果 透射電鏡鑒定外泌體結果顯示，差速離心法提取到的外泌體具有雙層膜結構，形態呈“杯托”樣，粒徑約為50～100 nm，符合外泌體的形態特征，見圖1。Western blot檢測外泌體標志結果顯示，差速離心法提取到的外泌體表達外泌體標志蛋白TSG101、HSP70、CD63、CD9，符合外泌體生物學特征，可用于后續研究，見圖2。

圖1 透射電鏡觀察外泌體形態結果

圖2 Western blot檢測外泌體標志蛋白結果

2.2 骨肉瘤外泌體促進MRC-5細胞增殖能力 CCK8檢測骨肉瘤外泌體對MRC-5細胞增殖能力，結果顯示，與PBS組相比，hFoB1.19 exo組細胞的增殖能力無顯著變化(P>0.05)，U2-OS exo和MG-63 exo組MRC-5細胞增殖能力顯著增加(P<0.01)，說明骨肉瘤外泌體能夠顯著促進MRC-5細胞的增殖能力，見圖3。

圖3 CCK8法檢測骨肉瘤外泌體對MRC-5細胞增殖能力的影響

2.3 骨肉瘤外泌體促進MRC-5細胞遷移能力 Transwell小室法檢測細胞遷移結果顯示，與PBS組相比，hFoB1.19 exo組細胞遷移數無顯著變化(P>0.05)，U2-OS exo和MG-63 exo組MRC-5細胞遷移數目顯著高于PBS組(P<0.001)，說明U2-OS exo和MG-63 exo組MRC-5細胞遷移能力顯著增加，提示骨肉瘤外泌體可顯著促進MRC-5細胞遷移能力，見圖4。

圖4 Transwell小室法檢測骨肉瘤外泌體對細胞遷移能力影響結果(20×)

2.4 骨肉瘤外泌體促進MRC-5細胞侵襲能力 細胞侵襲實驗檢測骨肉瘤外泌體對MRC-5細胞侵襲能力，結果顯示，與PBS組相比，hFoB1.19 exo組細胞侵襲數無顯著變化(P>0.05)，U2-OS exo和MG-63 exo組MRC-5細胞侵襲能力顯著增加(P<0.001)，提示骨肉瘤外泌體可顯著促進MRC-5細胞侵襲能力，見圖5。

圖5 細胞侵襲實驗檢測骨肉瘤外泌體對細胞侵襲能力影響結果(20×)

2.5 骨肉瘤外泌體促進MRC-5細胞IL-1β、IL-6、IL-8表達 QRT-PCR檢測與外泌體共孵育后MRC-5細胞中炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8表達，結果顯示，與hFoB1.19細胞外泌體共孵育后，MRC-5細胞中IL-1β、IL-6、IL-8的表達與PBS組相比無顯著差異(P>0.05)，

與U2-OS和MG-63細胞分泌的外泌體共孵育后，MRC-5細胞中炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8表達顯著增加(P<0.001)，說明骨肉瘤外泌體能夠促進成纖維細胞中炎癥因子的表達，即骨肉瘤外泌體促進成纖維細胞向腫瘤相關成纖維細胞的轉化，見圖6。

圖6 qRT-PCR檢測骨肉瘤細胞外泌體對MRC-5細胞中炎癥因子表達的影響

2.6 骨肉瘤外泌體促進MRC-5細胞α-SMA、Vimentin、FAP表達 Western blot檢測骨肉瘤外泌體對MRC-5細胞α-SMA、Vimentin、FAP表達的影響，結果顯示，與PBS組相比，hFoB1.19 exo組MRC-5細胞α-SMA、Vimentin、FAP表達無顯著變化(P>0.05)，U2-OS exo和MG-63 exo組MRC-5細胞α-SMA、Vimentin、FAP表達顯著增加(P<0.001)，見圖7。α-SMA、Vimentin、FAP是腫瘤相關成纖維細胞標志蛋白，說明骨肉瘤外泌體能夠促進成纖維細胞向腫瘤相關成纖維細胞的轉化。

圖7 Western blot檢測骨肉瘤外泌體對MRC-5細胞α-SMA、Vimentin、FAP表達的影響

2.7 骨肉瘤外泌體激活JAK2/STAT3信號通路 Western blot檢測骨肉瘤外泌體對MRC-5細胞JAK2/STAT3信號通路的影響，結果(圖8)顯示，相比于PBS組，hFoB1.19 exo組MRC-5細胞JAK-2和STAT3磷酸化水平無顯著變化(P>0.05)，U2-OS exo和MG-63 exo組MRC-5細胞JAK-2和STAT3磷酸化水平顯著增加(P<0.001)，說明骨肉瘤外泌體能夠顯著激活MRC-5細胞JAK2/STAT3信號通路，提示骨肉瘤外泌體能夠激活JAK2/STAT3信號通路而促進成纖維細胞向腫瘤相關成纖維細胞轉化。

圖8 Western blot檢測骨肉瘤外泌體對JAK2/STAT3信號通路激活的影響

3 討論

腫瘤相關成纖維細胞是腫瘤微環境中的重要組成部分，在腫瘤的發生、發展中發揮重要的作用。研究表明，腫瘤相關成纖維細胞并非獨立存在，而是伴隨在腫瘤微環境中，調控腫瘤的生長與存活，并且可維持腫瘤的惡性傾向[11]。而大多數的腫瘤相關成纖維細胞是由局部組織固有的成纖維細胞轉化而來，腫瘤相關成纖維細胞的轉化受腫瘤微環境調控[12-14]。腫瘤細胞可將外泌體分泌至腫瘤微環境，并且可通過外泌體將腫瘤自身的遺傳信息轉移至腫瘤微環境中的其他細胞，進而促進腫瘤的發生、發展[15-16]。研究表明，腫瘤相關成纖維細胞的激活受腫瘤外泌體的調控[17-18]，如肺癌細胞外泌體可通過激活NF-κB信號通路促進成纖維細胞向腫瘤相關成纖維細胞的轉化，肝癌細胞亦通過外泌體促進腫瘤相關成纖維細胞的轉化，進而促進腫瘤的轉移。本研究主要探討了骨肉瘤外泌體對腫瘤相關成纖維細胞轉化的影響。

本研究發現，將骨肉瘤細胞分泌的外泌體和成骨細胞分泌的外泌體分別與成纖維細胞共孵育后，骨肉瘤細胞外泌體能夠顯著促進成纖維細胞增殖、遷移和侵襲能力，而成骨細胞外泌體則無此功能，說明骨肉瘤細胞外泌體具有調控成纖維細胞的功能。

腫瘤相關成纖維細胞可通過分泌IL-1β、IL-6、IL-8而調控腫瘤微環境中的免疫反應。α-SMA、Vimentin、FAP是表達于腫瘤相關成纖維細胞中的標志蛋白。為了探討骨肉瘤細胞外泌體是否能調控成纖維細胞向腫瘤相關成纖維細胞的轉化，將外泌體分別與成纖維細胞共孵育后檢測成纖維細胞IL-1β、IL-6、IL-8的表達和α-SMA、Vimentin、FAP的表達，結果顯示，骨肉瘤細胞外泌體可顯著上調成纖維細胞中IL-1β、IL-6、IL-8的表達和標志蛋白α-SMA、Vimentin、FAP的表達，這說明骨肉瘤外泌體可促進成纖維細胞向腫瘤相關成纖維細胞的轉化。

JAK/STAT信號通路是眾多細胞因子信號轉導的共同途徑，廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡以及炎癥等過程，JAK2蛋白的激活觸發STAT3的磷酸化。磷酸化的STAT3二聚化并轉移至細胞核，然后與靶基因分子結合并激活特定的基因翻譯[19-22]。JAK/STAT信號通路的激活可促進腫瘤相關成纖維細胞的激活，進而促進黑色素瘤血管新生。本研究發現，骨肉瘤細胞外泌體可促進成纖維細胞中JAK和STAT的磷酸化，即激活JAK/STAT信號通路。

4 結論

骨肉瘤細胞外泌體能夠通過激活JAK/STAT信號通路，促進成纖維細胞向腫瘤相關成纖維細胞的轉化，但外泌體中何種物質發揮作用，還需進一步研究。