大蒜素復配保鮮劑對大口黑鱸保鮮效果的影響

許 萍，黃 敏，廖 濤，熊光權，張金木，王炬光，耿勝榮，白 嬋，*

(1.湖北省農業科學院 農產品加工與核農技術研究所/湖北省農產品輻照工程技術研究中心，湖北 武漢 430064；2.四川省原子能研究院 輻照保藏四川省重點實驗室，四川 成都 610101)

大口黑鱸(Micropterussalmoides)，黑鱸屬，營養豐富，已逐漸成為最受大眾歡迎的魚種類之一[1]。然而，生鮮鱸魚容易腐敗變質，難以滿足日益增長的大眾需求，嚴重制約了相關產業的發展。因此，開發有效的鱸魚保鮮技術，延長貯藏時間并保證其品質已成為水產品保鮮領域的重要研究方向之一。

生物保鮮劑尤其是含有天然、無毒的植物提取成分的保鮮劑近年來進入大眾視野。大蒜素(allicin，AL)對多種細菌、真菌、病毒具有殺滅或抑制作用，且安全無毒、來源充足[2]。茶多酚(tea polyphenol，TP)是茶葉中多酚類物質及其衍生物的總稱，是較為常見的天然保鮮劑品種之一。葡萄籽提取物(grape seed extract，GSE)具有抗氧化、抗疲勞和抗菌等生物活性，在食品、藥品與化妝品等領域得到了廣泛應用。適宜的植物提取成分之間存在抗菌性的協同增效作用。若將多種具有不同效能的保鮮劑復配用于水產品保鮮，充分發揮每種保鮮劑優勢的同時，可以降低濃度，擴大殺菌范圍，提高防腐效果[3]。Hassanzade等[4]研究了殼聚糖和GSE復配對虹鱒魚片在4 ℃貯存下的保鮮效果，含有GSE的殼聚糖更有助于保持魚片的感官品質，并延長了貨架期。官愛艷等[5]研究發現：竹葉抗氧化物、茶多酚和乳酸鏈球菌素復配對海鱸魚肉有較好的保鮮效果，貨架期較對照組延長了6 d。然而，關于大蒜素、茶多酚和葡萄籽提取物三者復配作為鱸魚貯藏保鮮劑，及其保鮮作用的研究卻鮮有報道。

本研究將大蒜素、茶多酚和葡萄籽提取物3種天然植物提取成分復配后用于鱸魚保鮮，以菌落總數、汁液流失率、硫代巴比妥酸反應物(TBARS)值、pH值、揮發性鹽基氮(TVB-N)值、感官評價及肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活力為指標進行鱸魚冷藏貨架期的品質分析，以期通過效能互補、協同保鮮，探究復配保鮮劑保鮮效果，旨在為開發以植物提取物為原料的鱸魚復配保鮮劑提供一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大口黑鱸(統稱鱸魚)，購自湖北省武漢市武商量販超市，挑選健康、大小一致，體重約450 g，體長約28 cm的鱸魚作為實驗原料。大蒜素(純度20%)，實驗室自主方法提取[6]；茶多酚、葡萄籽提取物(食品級，純度均為98%，粉末狀)，西安匯林生物科技有限公司；平板計數瓊脂培養基、生化試劑，青島海博生物技術有限公司；氯化鈉、三氯乙酸、氯仿、硫代巴比妥酸、鹽酸、無水碳酸鈉、氧化鎂、硼酸、甲基紅、溴甲酚綠、體積分數95%乙醇，中國醫藥(集團)上海化學試劑有限公司；超微量Ca2+-ATPase測試盒，南京建成生物工程研究所。如無特殊說明，所用化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

YM 50型立式壓力蒸汽滅菌器，上海三申醫療器械有限公司；THZ-98B型恒溫培養搖床，上海一恒科學儀器有限公司；HF safe-1200 A2型生物安全柜，香港力康公司；HH-S6型恒溫水浴鍋，鄭州杜甫儀器廠；UH5300型紫外可見分光光度計，日本日立公司；3K15型臺式高速冷凍離心機，美國Sigma公司；GB-1000型全自動真空包裝機，康貝特食品包裝器械有限公司；SPARK型酶標儀，瑞士TECAN 儀器公司；FE20型pH計，武漢永盛科技有限公司；K9860型全自動凱氏定氮儀，濟南海能儀器公司。

1.3 實驗方法

1.3.1復配保鮮劑的配制

準確稱取不同質量的大蒜素、茶多酚和葡萄籽提取物，用無菌蒸餾水配制質量分數為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的大蒜素、茶多酚、葡萄籽提取物保鮮劑，所有生物保鮮劑均貯存于4 ℃冰箱中預冷備用。鱸魚復配保鮮劑配方質量分數按如下工藝確定：進行3種保鮮劑配比的單因素實驗和響應面試驗，設置大蒜素、茶多酚、葡萄籽提取物質量分數為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%進行單因素實驗，分別在貯藏第 0、3、6、9、12天檢測鱸魚菌落總數、TBARS值和汁液流失率，最終選定0.2%、0.3%、0.4%作為大蒜素、茶多酚和葡萄籽提取物的低、中、高水平，并以貯存9 d鱸魚的 TBARS 值為響應值，進行三因素三水平響應面試驗，對復配保鮮劑配方進行優化，優化復配比為0.40%大蒜素、0.32%茶多酚和0.34%葡萄籽提取物，此工藝下得到的鱸魚TBARS值最低。控制環境溫度低于10 ℃，按優化復配比用無菌蒸餾水配制復配保鮮劑，所有復配保鮮劑均貯存于4 ℃冰箱中預冷備用。

1.3.2鱸魚樣品處理

將購買的鮮活鱸魚裝在有冰塊的泡沫箱內于30 min內運至實驗室。控制環境溫度低于10 ℃，將購買的鱸魚立即宰殺，去頭、尾、鱗、內臟，沿脊骨將魚肉剖成2片，揭去魚皮，取背部魚肉切成約4.0 cm×4.0 cm×1.0 cm的魚塊，用預先煮沸冷卻及紫外殺菌后的冷蒸餾水清洗干凈，濾紙吸取表面的水分。大蒜素處理組(AL組)、大蒜素復配保鮮劑處理組(AL+TP+GSE組)為魚塊隨機放入預冷的大蒜素、大蒜素復配保鮮劑中并浸泡30 min，對照組為放入預冷的蒸餾水中同樣浸泡30 min。將浸泡完成的魚塊取出，并于放置了無菌紗布的雙層瀝水籃上瀝干，分裝于高溫蒸煮袋中真空包裝，貯存于4 ℃冰箱中。每3 d進行1次取樣，對分別貯藏0、3、6、9、12、15 d時鱸魚的菌落總數、汁液流失率、TBARS值、pH值、TVB-N值和肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活力、感官評分進行測定。

1.3.3菌落總數的測定

參照GB/T 4789.2—2016《食品微生物學檢測菌落總數的測定》進行[7]。在超凈工作臺中，采用梯度稀釋法，首先稱取10 g剪碎的魚肉樣品于90 mL無菌生理鹽水中，混合均勻，此為第一梯度稀釋，依次每次從上一梯度溶液中移取1 mL加入到9 mL無菌生理鹽水中，渦旋混勻。取15～20 mL瓊脂培養基于培養皿中，再分別在每一梯度的溶液中取出1 mL加入培養皿中，輕晃均勻，水平放置。待瓊脂培養基完全凝固后，倒置于培養箱中，在(30±1)℃條件下，按照水產品培養(72±3)h的要求進行培養，每個梯度重復實驗3次，按照國標進行菌落總數計數，單位為CFU/g。

1.3.4汁液流失率的測定

分別稱量經過不同保鮮劑處理的完整包裝樣品的質量(m1)；打開包裝袋，將包裝袋內的汁液倒出，將魚肉表面及袋內殘留的汁液用吸水紙吸干，稱量包裝袋和魚肉總質量(m2)；包裝袋單獨稱重(m3)。汁液流失率按式(1)計算。

(1)

1.3.5硫代巴比妥酸反應物的測定

在Zhu等[8]的方法上進行一定改進測量脂質氧化產生的次級產物TBARS。取5 g魚肉樣品，剪碎，加入3 mL體積分數7.5% 三氯乙酸、體積分數0.1%酸丙酯、質量分數0.1%EDTA混合溶液后均質，真空過濾。取2.5 mL濾液與相同體積的0.02 mol/L 2-硫代巴比妥酸混合后在90 ℃下加熱30 min，冷卻至室溫。取5 mL上清液，加入5 mL氯仿，于2 000 r/min下離心10 min，測定上清液在532 nm的吸光度，TBARS值以1 kg肌肉樣品中所含丙二醛的毫克數表示，mg/kg。TBARS值計算見式(2)。

(2)

式(2)中，A532，上清液在532 nm下的吸光度；m，魚肉樣品質量，g；9.24，由樣品稀釋和摩爾消光系數得到的常數。

1.3.6pH值的測定

稱取10 g碎魚肉于具塞三角瓶中，加入100 mL蒸餾水，混合均勻，控制環境溫度20 ℃，靜置30 min后，離心，過濾，取上清液50 mL，用pH計進行測定。

1.3.7揮發性鹽基氮的測定

參照GB/T 5009.228—2016《食品中揮發性鹽基氮的測定》進行[9]。

1.3.8肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活力的測定

稱取鱸魚魚肉10 g，剪碎，加入90 mL 4 ℃的生理鹽水，冰水浴條件下勻漿后，在4 ℃下離心20 min (2 500 r/min)。取上清液用4 ℃的生理鹽水稀釋成質量分數1%組織勻漿，按Ca2+-ATPase測定試劑盒說明書進行測定，單位為U/mg。

1.3.9感官評價

感官評價小組由6名成員組成，所有成員在感官培訓前，均先熟悉了鱸魚的感官特征。以鱸魚的顏色、氣味、肌肉彈性和肌肉組織狀態為評分對象，進行感官評價，采用5分制進行評估：非常理想為5分，可取的為4分，可以接受的為3分，無法接受的為2分，非常不能接受為1分。總感官評分20分，12分為不能接受的界限[10]。

1.4 數據處理

每個實驗設3次重復，取平均值。采用Origin 8.5軟件進行圖形繪制，采用SAS 8.1 軟件進行方差分析，顯著性水平設置為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 復配保鮮劑對鱸魚菌落總數的影響

微生物是造成水產品腐敗的主要因素之一，菌落總數能反映腐敗的程度。保鮮劑處理后鱸魚菌落總數變化見圖1。由圖1可知，鱸魚初始菌落總數為3.57 lg(CFU/g)，這與之前的報道類似[11]，表明鱸魚貯藏初期質量良好。隨著貯藏時間的延長，對照組在第9天時，菌落總數已經超過新鮮魚片菌落總數可接受限度值7 lg(CFU/g)[12]；而大蒜素處理組和復配保鮮劑處理組均符合水產品食用標準。當貯藏到第12天時，經大蒜素處理的鱸魚菌落總數為7.08 lg(CFU/g)，達到了貯藏終點；而經過復配保鮮劑處理的鱸魚，其菌落總數為6.25 lg(CFU/g)，直到貯藏第15天，其菌落總數為7.04 lg(CFU/g)，達到貯藏終點。因此，對照組貨架期約為9 d，經大蒜素處理的鱸魚貨架期約為12 d；而經復配保鮮劑處理的鱸魚，其貨架期達到了15 d，較對照組約延長了6 d。大蒜素處理可以明顯抑制微生物的生長，大蒜素分子中的氧原子可與細菌繁殖時所需的半胱氨酸或各種酶的巰基發生化學反應，使細菌體內重要氧化反應不能正常進行，從而使病菌致死，具有較好的抑菌作用。茶多酚也可與細菌體內酶結合使之失活從而達到抑菌的作用。大蒜素、茶多酚和GSE的復配進一步產生協同抑菌效果，降低菌落總數，延長了鱸魚貨架期，可作為鱸魚保鮮的綠色保鮮劑。

圖1 不同保鮮劑處理對鱸魚菌落總數的影響Fig.1 Effects of different preservative treatments on total viable count of weevers

2.2 復配保鮮劑對鱸魚汁液流失率的影響

水產品在貯藏過程中會產生一定的汁液流失，這是由于微生物繁殖使得肌肉組織細胞分解，產生汁液[13]。同時產生的汁液也為微生物生長提供了可能，加速了水產品的腐敗和營養成分的流失。保鮮處理后4 ℃下貯藏的鱸魚汁液流失率的變化見圖2。由圖2中可知，整個貯藏期，汁液流失率隨著貯藏時間的延長而逐漸增大。在貯藏初期，經過大蒜素和復配保鮮劑處理的鱸魚，汁液流失率略高于對照組，這是由于保鮮劑處理使得肌肉組織表面暫時失去了平衡；但在后續貯藏中，這2種處理鱸魚的方式均使得汁液流失率顯著低于對照組(P<0.05)。貯藏末期，大蒜素處理組汁液流失率較對照組低了3.85%，復配保鮮劑處理組汁液流失率較對照組低11.77%，這表明復配保鮮劑的加入可以延緩汁液流失，較好地保證產品質量。這可能是因為保鮮劑使微生物的生長受到抑制，從而減緩了鱸魚肌肉組織分解、蛋白質變性和降解的速率，維持了肌肉組織的致密性，使得產品保持良好的平衡。

圖2 不同保鮮劑處理對鱸魚汁液流失率的影響Fig.2 Effects of different preservative treatments on juice loss rate of weevers

2.3 復配保鮮劑對鱸魚硫代巴比妥酸反應物的影響

在水產品貯藏過程中，脂質易氧化生成不穩定的氫過氧化物，并進一步分解出次級產物，TBARS值表示脂質氧化形成次級產物的程度，可作為水產品脂肪氧化程度的評價指標[14]。一般當水產品肌肉TBARS值達到1.0～2.0 mg/kg時，脂質氧化生成的醛類和酮類小分子產生的惡臭味道已經使水產品失去了食用價值[15]。鱸魚貯藏期間TBARS值見圖3，貯藏初期為0.24～0.35 mg/kg。隨著貯藏時間的增加，各組鱸魚樣品的TBARS值均呈現上升趨勢。對照組的TBARS值由最初的0.35 mg/kg上升到貯藏第15天的1.48 mg/kg。貯藏的15 d內，大蒜素處理組、復配保鮮劑處理組的TBARS值均顯著低于對照組(P<0.05)。在貯藏第15天時，大蒜素處理組的TBARS值為1.20 mg/kg，而復配保鮮劑處理組的TBARS值為0.84 mg/kg。表明大蒜素對延緩鱸魚脂質氧化具有一定的效果，而復配保鮮劑則對延緩鱸魚TBARS值升高的效果更好。茶多酚和GSE作為肉類保鮮劑時均具有強抗氧化性，從而使得復配保鮮劑能有效延緩脂肪氧化。復配保鮮劑可作為鱸魚保鮮劑，在延緩鱸魚脂肪氧化中優于單獨使用大蒜素保鮮劑。

圖3 不同保鮮劑處理對鱸魚硫代巴比妥酸反應物的影響Fig.3 Effects of different preservative treatments on TBARS value of weevers

2.4 復配保鮮劑對鱸魚pH值的影響

水產品的腐敗與pH值的變化緊密相關，而pH值與魚宰殺后肌肉變化過程有關，鮮魚宰殺后肌肉的正常pH值一般在6～7[16]。保鮮處理后，鱸魚pH值變化見圖4。對照組、大蒜素處理組和復配保鮮劑處理組的初始pH值分別為6.94、6.90和6.83。隨著貯藏時間的延長，各組鱸魚pH值均呈現先下降后上升的趨勢。貯藏初期的下降可能是由于在魚的僵死階段，厭氧糖酵解過程產生了丙酮酸，進而產生并積累了乳酸；而后期的增加可能是由于微生物和內源酶的作用，造成了生物胺和氨等堿性化合物的積累[17]。在整個貯藏期，與對照組相比，復配保鮮劑處理組使鱸魚的pH值顯著降低(P<0.05)，pH值上升的趨勢也更為平緩；而大蒜素處理組與對照組無明顯差異(P>0.05)。說明復配保鮮劑中茶多酚和GSE在維持魚肉pH值穩定方面起主要作用，而三者協同作用后對由微生物引起的堿性化合物的增加有明顯抑制作用，較單獨的大蒜素處理更有效。

圖4 不同保鮮劑處理對鱸魚pH值的影響Fig.4 Effects of different preservative treatments on pH value of weevers

2.5 復配保鮮劑對鱸魚揮發性鹽基氮的影響

TVB-N主要是由微生物作用引起的肌肉蛋白及非蛋白含氮化合物的分解產生的，由三甲胺、二甲胺、氨以及其他含氮化合物組成，是判斷魚肉腐敗程度的重要指標[18]，一般認為魚肉的TVB-N值可接受范圍應低于25 mg/100 g[19]。貯藏期間，鱸魚TVB-N值的變化見圖5。本研究中，TVB-N值隨著貯藏時間延長不斷增加。在整個貯藏周期(15 d)，大蒜素處理組和復配保鮮劑處理組的TVB-N值均顯著低于對照組(P<0.05)，復配保鮮劑組TVB-N值最低，增速最慢。對照組在貯藏第9天時達到24.7 mg/100 g，接近可接受范圍的最大值；而大蒜素處理組在第12 天達到26.0 mg/100 g，復配保鮮劑組在第15天達到25.9 mg/100 g，超出可接受值。這可能是由于大蒜素及茶多酚、GSE處理造成細菌總數的快速減少，降低了細菌對非蛋白類的含氮化合物的氧化去氨基能力。單獨的大蒜素處理可以抑制微生物生長，并在一定時間內減少鱸魚魚肉中蛋白質降解，但與茶多酚和GSE復配后可以更有效抑制微生物生長，從而延長鱸魚貨架期，減緩貯藏過程中TVB-N值的上升速率。Feng等[18]發現茶多酚復合臭氧水處理黑鯛比單獨處理可以更有效地抑制微生物，與本研究得到的結果類似。

圖5 不同保鮮劑處理對鱸魚揮發性鹽基氮的影響Fig.5 Effects of different preservative treatments on TVB-N value of weevers

2.6 復配保鮮劑對鱸魚肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活力的影響

肌原纖維蛋白的完整性可用ATP 酶的活力來評價，Ca2+-ATPase活力越高，肌原纖維蛋白的完整性越好[20]。Ca2+-ATPase活力變化見圖6。由圖6可知，在貯藏初期，肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活力為2.04 U/mg；隨著貯藏時間的延長，對照組和處理組肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活力均有所下降。與貯藏初期相比，貯藏15 d后，對照組和大蒜素處理組酶活力分別下降59.9%和47.6%；而復配保鮮劑組下降38.0%。整個貯藏期間，對照組Ca2+-ATPase活力顯著低于大蒜素處理組和復配保鮮劑組(P<0.05)。這可能是與鱸魚死后肌肉發生魚體僵直、自溶及腐敗變質等復雜理化變化有關。Ca2+-ATPase 活力下降的原因是肌原纖維蛋白中巰基被氧化，形成二硫鍵導致分子聚合，也可能是肌球蛋白頭部的構象變化及聚合導致Ca2+-ATPase 活力下降。本研究表明：經過大蒜素和復配保鮮劑處理后的鱸魚，肌原纖維蛋白的完整性被破壞的速率減慢，且蛋白完整性始終高于對照組。大蒜素具有較強的抑菌性，結合茶多酚和GSE的強抗氧化性，降低了微生物對魚肉氫鍵的破壞力，維護了蛋白質的穩定性，延緩了Ca2+-ATPase活力的下降[21]。

圖6 不同保鮮劑處理對鱸魚Ca2+-ATPase活力的影響Fig.6 Effects of different preservative treatments on Ca2+-ATPase activity of weevers

2.7 復配保鮮劑對鱸魚感官評價的影響

感官評價是判斷魚體是否腐敗的一個重要指標[22]。感官評價主要對鱸魚的顏色、氣味、肌肉彈性和肌肉組織狀態進行評價(圖7)，可接受的最低限度為12分。由圖7可知，在第0天時，對照組和處理組鱸魚樣本感官評分均較高，品質優良。在低溫條件下，隨著貯藏時間的延長，所有鱸魚樣品的品質均顯著下降。對照組在貯藏9 d時，感官評分為11.50分，已經低于品質要求的最低限度，判定其不可再食用；而此時，大蒜素處理組和復配保鮮劑處理組感官評分分別為13.00分和15.17分，仍然滿足食用要求。大蒜素處理組和復配保鮮劑處理組感官評分分別在第12天和第15天低于品質要求最低限度。因此，大蒜素處理組和復配保鮮劑處理組均能有效保持鱸魚品質，且貨架期分別延長3 d和6 d，與菌落總數變化分析、TVB-N值分析得出的結果一致。

圖7 不同保鮮劑處理對鱸魚感官評價的影響Fig.7 Effects of different preservative treatments on sensory evaluation of weevers

3 結 論

結合冷藏期間大口黑鱸魚肉各化學指標(pH值、TVB-N值)、菌落總數、感官指標(氣味、色澤、組織狀態和肌肉彈性)、脂質氧化指標(TBARS值)、肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活力分析，大蒜素及大蒜素復配保鮮劑(大蒜素、茶多酚和葡萄籽提取物復配)作為鱸魚保鮮劑具有良好的保鮮作用，能夠有效抑制冷藏鱸魚魚肉中微生物的生長繁殖、魚肉脂質氧化和腐敗變質，延緩了鱸魚貯藏過程中汁液流失、TVB-N值的上升，更好地保持了鱸魚蛋白質結構的穩定性，使肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活力下降減緩；而3種保鮮劑復配在鱸魚保鮮中具有協同增效作用，較單一大蒜素處理具有更好地保鮮效果。大蒜素單一處理及3種保鮮劑復配處理與對照組相比分別可以延長鱸魚貨架期3 d與6 d。3種保鮮劑安全、無毒、易得，在水產品保鮮領域具有較為廣闊的應用前景。