釀酒酵母多物混合發酵對咖啡豆風味品質的影響

趙林芬，弘子姍，楊 凱，龔加順，譚 超

(云南農業大學 食品科學技術學院，云南 昆明 650201)

咖啡豆(coffee bean)是茜草科(Rubiaceae)咖啡屬(Coffea)植物的種子[1]。作為一種古老的天然飲品，咖啡具有多種活性成分，烘焙后散發誘人的芳香[2-3]。云南是中國第一個種植咖啡的省份，也是目前我國最大的咖啡產地，主要種植小?？Х?CoffeaarabicaLinn.)。種植區主要分布在云南西南部的保山、臨滄、普洱、版納、怒江等地，那里大部分海拔超過1 000 m[4]。得天獨厚的自然條件，海拔和緯度造就了云南咖啡酸味適中、濃而不苦、香味醇和、略帶果味的特質[5]，但與瑰夏(Geisha)等精品咖啡相比，云南咖啡豆花果甜香風味不足?？Х蕊L味不僅受品種和種植環境的影響，采收后加工過程中發酵環節也起到至關重要的作用[6]。

國內外主要聚焦于咖啡風味成分分析及烘焙對風味的影響研究，針對咖啡發酵風味的研究相對不多。近年來，微生物發酵對咖啡風味品質形成的影響研究逐漸成為熱點。佟世生等[7]對酶解偶聯發酵處理的云南小?？Х弱r果和生豆進行電子舌分析，發現通過酶解偶聯發酵咖啡鮮果可以得到與天然麝香貓咖啡風味相同的咖啡豆。Wang等[8]通過添加葡萄糖控制乳酸乳球菌亞種(Lactococcuslactissubsp.cremoris)發酵生咖啡豆，發現乳酸乳球菌亞種可顯著提高咖啡的風味屬性。魏敏等[9]研究了桑腸桿菌(EnterobactermoriL4-3，CCTCC M2012020)發酵對咖啡提取物揮發性成分的影響，發現發酵后咖啡提取物中帶有咖啡特征香氣的同時還帶有濃郁堅果、奶香等豐富香氣，刺激性成分、苦澀感減少。這些研究均是利用微生物在咖啡本身風味特質的基礎上進行的改善研究，通過外添天然的風味物質利用微生物發酵過程改善咖啡風味品質的研究報道較少。

釀酒酵母又稱面包酵母或出芽酵母，適宜生長溫度為25～30 ℃，在低溫條件下非酒精發酵時，會抗性生長，累積包括揮發性醇、酯、酚、酮、芳香族等豐富的香氣成分[10]。本研究擬在云南咖啡鮮果中添加可能提供香料氣味(肉桂、香草)、水果氣味(蘋果、甜橙、香蕉)、甜香氣味(蜂蜜)的底物，利用釀酒酵母發酵混合物，對發酵后的咖啡生豆進行理化性質、香氣成分分析，以及對烘焙后的咖啡風味進行主觀評價。探索混合發酵對咖啡花果甜香風味的改善，為進一步改善云南咖啡花果甜香特質，提升咖啡風味提供一定理論依據和數據支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

咖啡鮮果(CoffeaarabicaLinn.，2018年云南省普洱市苡榕莊園產)；釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae，2018年安琪酵母股份有限公司產)；白砂糖，太古糖業(中國)有限公司；百花蜂蜜，云南農業大學東方蜜蜂研究所；蘋果、甜橙、香蕉、肉桂、香草，市售；其他實驗試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

EU-K1-20T型超純水機，南京歐鎧環境科技有限公司；TGC20M型離心機，湖南湘立科學儀器有限公司；KDN-04B型凱氏定氮儀，浙江托普儀器有限公司；SOX406型索氏抽提儀，濟南阿爾瓦儀器有限公司；METTLER TOLEDO HS153型水分測定儀，上海銳析儀器設備有限公司；Brewista型200 mL專業咖啡杯測碗勺，蘇州順和豐家電科技有限公司；R500F型咖啡烘焙機，北京三豆客科技有限公司；SW-CJ-2D型超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；FlavourSpec?型氣相離子遷移色譜儀，濟南海能儀器股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1咖啡鮮果的發酵

咖啡鮮果用超純水清洗浸泡3 min后經121 ℃滅菌15 min。白砂糖、蜂蜜、蘋果、甜橙、香蕉、肉桂、香草原料經紫外照射滅菌30 min。滅菌后的咖啡鮮果和風味底物放入超凈工作臺中備用。樣品設置為A～F共6個組，3個平行，每種樣品按m(咖啡鮮果)∶m(釀酒酵母)∶m(風味底物)=60 g∶3 g∶37 g配制，風味底物按每個樣品質量分數配比，包括對照組A為水37%；香料組B為肉桂粉1.5%、香草粉1.5%、水34%；蘋果組C為蘋果18%、糖2.4%、水16.6%；甜橙組D為甜橙18%、糖2.4%、水16.6%；香蕉組E為香蕉18%、糖2.4%、水16.6%；蜂蜜組F為蜂蜜6%、水31%。配制好的樣品裝入滅菌后的蒸煮袋，并真空封裝。于20 ℃恒溫發酵24 h后隔袋手工揉捻讓咖啡豆與果皮分離，再繼續20 ℃恒溫發酵24 h，取出分離咖啡豆于不銹鋼托盤中40 ℃鼓風干燥至豆體水分質量分數為10%～12%。

1.3.2咖啡生豆的烘焙

根據中度烘焙豆在香氣和口感上的相對優勢，采用中度烘焙[11]。準確稱取100 g咖啡豆，置于咖啡烘焙機中烘焙，入豆溫度150 ℃，并以5 ℃/min升溫，12 min后溫度達到210 ℃后恒溫烘焙，當咖啡豆烘焙時產生第一次爆破音后10 s迅速出豆冷卻，烘焙咖啡豆艾格壯數值(Agtron number)為58±1，研磨粉艾格壯數值為63±1，裝入帶單向透氣閥的袋子放置24 h。

1.3.3烘焙咖啡豆風味的感觀評價方法

咖啡風味的主觀評價，也稱為咖啡杯測，是采用美國精品咖啡協會(Specialty Coffee Association of America,SCAA)所設立的標準，利用人的嗅、味、觸覺來評價咖啡的品質。本研究參考SCAA評分標準[12]，每個樣品5次重復。將烘焙后咖啡豆磨粉后過美標20目網篩，取過篩后的咖啡粉(11±0.25)g加入200 mL 93 ℃的超純水靜置3 min后開始評定。評定指標包括干/濕香氣、風味、余韻、酸質、體脂感、一致性、平衡性、干凈度、甜度等級、綜合考慮10項，最終扣除瑕疵度分值，得到最終分數。杯測表從6分開始標注，一共分為4個級別，6分為“好”；7分為“非常好”；8分為“優秀”；9分為“超凡”。每個等級又分4個給分等級，給分單位是0.25分，4個等級共16個給分點。最終得分高于80分，即為精品級。

1.3.4混合發酵后咖啡生豆的理化性質測定

總灰分的測定按GB 5009.4—2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》方法；水分含量的測定采用METTLER TOLEDO HS153型快速水分測定儀；還原糖含量的測定按GB 5009.7—2016《食品安 全國家標準 食品中還原糖的測定》直接滴定法；多糖含量的測定采用蒽酮-硫酸比色法[13-14]；脂肪含量按GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中 脂肪的測定》索式抽提法；蛋白質含量的測定按GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白 質的測定》凱氏定氮法。可溶性蛋白質含量采用考馬斯亮藍G250染色法[15]；多酚含量參考GB/T 31740.2—2015《茶制品 第2部分：茶多酚》的方法。

1.3.5揮發性成分的測定

氣相色譜條件：1 g樣品于20 mL頂空進樣瓶中，40 ℃平衡20 min，取頂空氣體進樣200 μL用GC-IMS進行測試，載氣N2，進樣針溫度45 ℃，色譜柱FS-SE-54-CB-1(15 m×0.53 mm，1 μm)，柱溫箱溫度60 ℃，載氣流速程序為0～2 min，2 mL/min；2～10 min，2～15 mL/min；10～20 min，20～80 mL/min；20～40 min，100～130 mL/min。離子遷移譜條件：漂移管長度98 mm；管內線性電壓500 V/cm；漂移管溫度45 ℃；漂移氣N2；漂移氣流速150 mL/min；離子源β-射線(氚)；離子化模式為正離子。

1.4 數據分析

采用Excel 2017進行數據整理，采用IBM SPSS 22進行數據差異性分析，采用Laboratory Analytical Viewer和GC×IMS Library Search Software分析樣品中揮發性有機物的差異譜圖，并結合NIST數據庫和IMS數據庫對物質初步定性。

2 結果與分析

2.1 混合發酵咖啡生豆理化性質分析

將發酵完畢的咖啡生豆樣品A～F組進行理化分析，結果見表1。

表1 混合發酵后的咖啡生豆基本理化成分Tab.1 Basic chemical components of coffee beans after mixed fermentation g/100 g

對6組發酵完畢的咖啡生豆進行理化分析表明，添加不同風味底物的咖啡生豆B～F組中脂肪和灰分的含量與對照組A均無顯著差異(P>0.05)，但咖啡生豆可溶性蛋白質含量比對照組A均顯著增加(P<0.05)，增加的可溶性蛋白質可能來源于添加的風味底物，因為釀酒酵母利用碳水化合物進行生長代謝，合成可溶性蛋白質的能力較弱。香料組B的還原糖、總蛋白質、可溶性蛋白質含量是所有組中最高的，分別為(8.28±0.39)、(6.34±0.32)、(1.87±0.01)g/100 g，其中還原糖在蘋果組C、甜橙組D中差異顯著(P<0.05)，總蛋白質在甜橙組D、香蕉組E中差異顯著(P<0.05)。有研究表明，發酵后的香草還原糖可達14.58%，肉桂中蛋白質質量分數約11.70%[16]，這可能是導致香料組B還原糖、總蛋白質最高的原因之一。蘋果組C添加了2.4%蔗糖，發酵過程中糖會轉化為酸類，同時蘋果本身含有大量酸類物質，因此蘋果組C的總酸含量在所有組中最高為(7.99±0.49)g/kg與香蕉組E差異顯著(P<0.05)，但與其他組差異不明顯。添加了蔗糖的蘋果組C、甜橙組D、香蕉組E，還原糖的變化情況與對照組A相比參差不齊，排除一定程度上的統計誤差，可認為外來糖源的添加會對咖啡豆還原糖含量造成一定影響，其中蘋果組C、甜橙組D與對照組A相比還原糖含量顯著下降(P<0.05)。利用蜂蜜無氧發酵后，蜂蜜品質會降低，酸度增加，總糖和蔗糖含量下降[17]。蜂蜜組F酸度、多糖、還原糖含量與對照組A相比有變化，但變化不明顯(P>0.05)，多酚質量分數最高為(3.16±0.09)g/100 g與對照組A、蘋果組C、甜橙組D差異顯著(P<0.05)，將其烘焙后進行風味主觀評價發現其酸味過重。

從理化分析結果來看，添加不同底物與咖啡發酵對咖啡豆中灰分和脂肪含量無影響(P>0.05)，但可顯著提高可溶性蛋白質的含量(P<0.05)，而風味底物的添加對最終咖啡豆中多糖、還原糖、總蛋白質、多酚具有不同的影響，表現為有的增加有的減少，有些顯著有些不顯著，變化無明顯規律，可能是受到添加風味底物本身的影響。

2.2 混合發酵咖啡生豆香氣分析

利用GC-IMS對發酵后的咖啡生豆香氣進行測試，在所有樣品中共檢出包括未知成分在內的53種化合物，結合GC-IMS自帶譜庫及NIST譜庫共定性出36種共有化合物，分別為9種酯類、6種酮類、8種醛類、6種醇類、5種烯萜、1種呋喃、1種酸類以及檢出17 個共有信號的未知成分(圖1)。通過計算相對含量(圖2)，所有咖啡生豆中酮、醛、醇、酯類共占檢出香味物質的60%以上，這4大類成分含量和豐富度也較高。添加不同的底物進行發酵會導致咖啡生豆中酮、醛、醇類(除蜂蜜組F外)含量均下降，酯類、烯萜、呋喃(除香料組B外)含量上升。

圖1 混合發酵后的咖啡生豆揮發性香氣相對含量熱圖Fig.1 Heat map of relative contents of volatile aroma in coffee beans after mixed fermentation

圖2 混合發酵咖啡生豆香氣成分相對含量匯總Fig.2 Summary of relative contents of aroma components of coffee beans after mixed fermentation

在A～F組發酵后的咖啡生豆香氣中，丙酮相對含量最高為12.6%～18.6%，在添加風味底物發酵后丙酮(辛辣、微甜、愉悅香氣、帶特征性芳香)、甲基異丁酮(香蕉、水果甜、愉悅香氣)、2-丁酮含量均有不同程度下降，其他酮類化合物有增有減。

生豆醛類物質中以壬醛(果味、脂肪、玫瑰香)、己醛(果味、木質味、蘋果味、草味、橙子味)、2-甲基丁醛(可可味、咖啡味、果味甜)為主各占4.25%～4.75%、3.55%～5.96%、1.51%～5.72%。在添加風味底物發酵后己醛、2-甲基丁醛、丁醛(發霉、雜味、發酵刺激味)、3-甲基丁醛(蘋果味、脂肪、杏仁味)、戊醛均有不同程度下降，其他醛類化合物有增有減。

生豆醇類物質中以乙醇(愉悅的酒精味)、異丙醇(尖銳、不愉快的燃燒味)為主，各占6.02%～7.13%、2.73%～3.18%，在添加風味底物發酵后乙醇、正戊醇、正己醇均有不同程度下降，3-甲基-3-丁烯-1-醇(水果香、草本、木質、甜美)有不同程度上升，其他醇類化合物的相對含量有增有減。

生豆中酯類物質最為豐富，以乙酸乙酯(香蕉、蘋果味、白葡萄、果香、甜美)、異戊酸乙酯(果味、酒味、甜味、發酵乳味)、乙酸丙酯(梨、覆盆子味、愉悅的苦甜)為主，各占2.81%～10.79%、1.05%～6.59%、1.52%～2.22%。在添加風味底物發酵后乙酸乙酯、異戊酸乙酯大幅度上升，丁酸乙酯不同程度上升，乙酸丁酯(果味、菠蘿味)、乙酸丙酯、己酸乙酯(果味、菠蘿味、香蕉味、煙味)下降，其他酯類化合物的相對含量有增有減。在酯類化合物中E組添加了香蕉的發酵咖啡酯類含量增加最為明顯，這與香蕉本身所帶有的酯類香氣物質存在較大關系。大量增加的乙酸乙酯和異戊酸乙酯能為咖啡香氣增加獨特的果香，與此同時E組酮類中丙酮、醛類中己醛、庚醛(果味、不愉快的脂肪味)、丁醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛下降最明顯，這在烘焙咖啡豆風味主觀評價中也得以體現。

烯萜具有香料香味，月桂烯(甜美、香酯、玫瑰、芹菜、胡蘿卜、薄荷、柑橘、熱帶水果味)、檸檬烯(甜橙、柑桔味)分別有類似肉桂和檸檬清淡的香氣，生豆中烯萜類中香料組B添加了肉桂和香草的咖啡苯乙烯大幅度增加318.52%，甜橙組D添加了甜橙的咖啡檸檬烯大幅增加501.72%。香料組B、甜橙組D在最終烘焙后風味主觀評價中也能夠表現出相應桂皮、香草、橙香。

香料、水果與咖啡發酵可以使得香料、水果本身所帶有的香氣賦予咖啡，提升咖啡花果香特質，蜂蜜與咖啡發酵在香氣方面未發現有突出特點，不同香料、水果對咖啡果香味提升有不同針對，因此如需特定提升某種花果香味尚需進行進一步的配比調和研究。

2.3 混合發酵后的烘焙咖啡豆風味感觀評價結果

對混合發酵后的烘焙咖啡豆風味進行感觀評價，得分見表2。香料組B和甜橙組D達到精品咖啡標準，得分超過80分，風味描述上可明顯辨識出精品咖啡中所希望呈現出的桂皮、香草、甜橙等加分風味。B～E組評分均高于對照組A，說明添加香料及水果在低溫厭氧條件下利用釀酒酵母發酵咖啡鮮果對最終的烘焙咖啡豆風味有一定提升。但蜂蜜組F酸度過高，風味主觀評價分低于對照組A，主要與釀酒酵母利用蜂蜜中糖類發酵產酸有關。烘焙咖啡豆風味主觀評價結果中所有樣品均存在酸度偏高、風味單一、苦味突出且醇厚度低的問題。這與釀酒酵母發酵糖類產酸有關，苦味主要來源于咖啡中綠原酸和咖啡因的變化。在利用釀酒酵母發酵咖啡增香的同時，如何抑制咖啡酸苦味的增加需進一步研究。

表2 混合發酵后的烘焙咖啡豆風味感觀評分Tab.2 Sensory score of flavor of roasted coffee beans after mixed fermentation

3 結 論

利用釀酒酵母在低溫厭氧條件下添加天然風味底物與咖啡發酵，與無底物對照組相比發酵后的咖啡生豆中灰分和脂肪含量無影響(P>0.05)，可溶性蛋白質的含量顯著提高(P<0.05)，而底物的添加對最終咖啡豆中多糖、還原糖、總蛋白質、多酚具有不同程度的影響，無明顯規律。對發酵后的咖啡生豆進行GC-IMS香氣分析，共定性出 36種共有化合物，9種酯、6種酮、8種醛、6種醇、5種烯萜、1種呋喃、1種酸類及17個共有未知信號成分。其中酮、醛、醇、酯類共占檢出香味物質的60%以上。對發酵后烘焙咖啡豆風味進行主觀評價，表明香料、水果與咖啡發酵可使其香氣賦予咖啡，提升咖啡花果香特質，其中香料組、甜橙組風味主觀評價達精品咖啡標準，香蕉組香氣較為突出。蜂蜜組在香氣方面未有突出特點，酸度較高、甜度不足。綜合理化、香氣成分和風味主觀評價結果來看，添加天然風味底物并利用釀酒酵母在低溫厭氧條件下發酵云南咖啡鮮果，能在一定程度上改善咖啡風味品質。