四種乳酸菌對馬拉硫磷的手性選擇性降解研究

石凱威, 鄭尊濤, 趙婷婷, 朱宇珂, 馬 成, 李 莉*,

(1. 中國科學院 動物研究所 農業蟲害鼠害綜合治理國家重點實驗室，北京 100101；2. 農業農村部農藥檢定所，北京 100125)

乳酸菌是可以發酵碳水化合物并產生大量乳酸的一類細菌的統稱，在自然界和食品中廣泛存在[1]，已廣泛應用于乳制品、肉制品、蔬菜制品和軟飲料等食品加工業中[2]。目前已經發現的乳酸菌有43個屬，包括373個種和亞種，按照形態可分為乳酸桿菌族和鏈球菌族[3-4]。

研究證明，乳酸菌及其發酵產物對部分有機磷農藥有較強的降解作用。王晶等[5-6]發現，保加利亞乳桿菌Lactobacillus、植物乳桿菌Lactobacillus plantarum和副干酪乳桿菌Lactobacillus paracasei3株乳酸菌對脫脂乳培養基上的7種有機磷農藥殘留有一定的降解作用；薄力影等[7]研究表明，選擇的7種有機磷農藥42 ℃條件下在牛奶樣品中的半衰期為11.0～16.7 h，而在兩個乳酸菌發酵的酸奶樣品中半衰期分別減少至9.6～14.6 h和10.0～15.9 h。目前，有關乳酸菌對手性農藥的選擇性降解報道較少，陸躍樂[8]研究發現，在有乳酸菌參與的醬油和泡菜加工過程中，S-禾草靈的降解快于其對映體，說明發酵過程中產生了選擇性降解。

馬拉硫磷是一種常用的有機磷農藥，有1個手性中心，2個對映異構體 (圖式1)。對馬拉硫磷對映異構體的拆分研究已經較為成熟，王鵬等[9-10]考察了流動相中改性劑種類、改性劑含量以及溫度對拆分效果的影響。結果表明，異丙醇、丁醇和異丁醇都適合作為改性劑，較低的醇含量和低溫都有利于分離效果的提高。馬拉硫磷異構體殺蟲活性和選擇性降解行為研究表明，R-對映體的殺蟲活性高于S-對映體，且將馬拉硫磷乳油在大白菜、葡萄、甜菜、水稻以及小麥上噴施后表現出不同的選擇性行為[11]；馬拉硫磷在黃土和紅土中的降解半衰期分別為3.5 h和4.3 h，左旋對映體降解較快[12]。馬拉硫磷對映體的神經毒性差異研究結果表明，R-對映體對神經細胞生長的抑制效應高于其外消旋體和S-對映體[13-14]；可見，對于馬拉硫磷的風險評估僅依靠外消旋體的數據是遠遠不夠的。

本研究采用培養基模擬方法，針對保加利亞桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌和干酪乳桿菌4種酸奶發酵中常用的乳酸菌種，對馬拉硫磷的手性選擇性降解進行了研究，能為推測酸奶釀制和儲存過程中手性農藥對映體選擇性降解，開展手性農藥在乳產品等食品中的風險評估，以及對人體的健康安全性評價提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及藥劑

Agilent 1260 高效液相色譜儀 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA USA)，配有紫外檢測器；Agilent 35900E型數模轉換器和IBZ旋光檢測器(IBZ Messtechnik GMBH公司)。

馬拉硫磷 (malathion) 標準品 (純度99.0%，Dr.Ehrenstorfer GmbH)，異丙醇和正己烷均為色譜純(Mallinckrodt Baker)。濃鹽酸、氫氧化鈉、乙腈、丙酮、石油醚和氯化鈉均為分析純 (國藥集團化學試劑有限公司)。弗羅里硅土固相萃取凈化柱和氨基固相萃取凈化柱 (1 g/6 mL，安譜實驗科技股份有限公司)。淋洗液為V(丙酮) :V(石油醚) = 1 : 9。

保加利亞桿菌Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus、嗜熱鏈球菌Streptococcus thermophilus、植物乳桿菌Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum和干酪乳桿菌Lactobacillus casei凍干菌粉 (中國普通微生物菌種保藏管理中心)。MRS培養基成分(分析純)：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，酵母粉4 g，葡萄糖20 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸三銨2 g，乙酸鈉5 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，吐溫-80 1 mL，蒸餾水1 000 mL。MRS培養基經過滅菌鍋121 ℃滅菌20 min，冷卻至室溫后待用。

1.2 立體選擇性降解試驗

1.2.1 含馬拉硫磷的 MRS 液體培養基的制備 在超凈工作臺中，將50 mg/kg馬拉硫磷外消旋體標準溶液添加至滅菌后的MRS液體培養基中，搖勻。取10 mL分裝至50 mL離心管中。

1.2.2 菌株傳代培養 在超凈工作臺中，將在 ?80 ℃冰箱中保存的乳酸菌甘油母液取出，在室溫條件下自然解凍，用移液槍 (配有滅菌后的槍頭) 以體積分數0.5%的接菌量接種在滅菌后的MRS液體培養基中，置于37 ℃搖床中恒溫培養，48 h后以0.5%的接菌量轉接于新的MRS液體培養基中。為確保菌株的穩定，傳代選在穩定期，以48 h為一個傳代周期。為保證乳酸菌的活性，使用第4代菌進行試驗。

1.2.3 接種和取樣 在超凈工作臺中，用移液槍(配有滅菌后的槍頭) 將活化后的第4代菌接種于含馬拉硫磷的MRS液體培養基中，接菌量分別為體積分數0 (對照)、0.5%和5.0%。接種后置于37 ℃搖床中恒溫培養，分別于0、2、4、8、20、32、48、96、168和288 h取樣測定馬拉硫磷對映體的含量，同時測定菌液的OD600值和pH值。每個處理重復3次。

乳酸菌的生長情況通過OD600值進行監測：取200 μL菌液至比色皿中，用蒸餾水稀釋至2 mL，用紫外分光光度計測定OD600值。

1.3 分析方法

1.3.1 樣品前處理 在10 mL MRS培養基中準確加入20 mL乙腈，振蕩1 min，加入6 g氯化鈉，混勻1 min，于3 000 r/min下離心5 min；取10 mL上清液至茄型瓶中，于35 ℃下旋轉蒸發至近干；用5 mL淋洗液預淋洗固相萃取柱，棄去淋洗液；用5 mL淋洗液洗滌茄型瓶中殘渣并轉移至固相萃取柱中，再用10 mL淋洗液分兩次洗脫；收集全部洗脫液，于35 ℃下旋轉蒸發至近干，用正己烷定容至2.5 mL，過0.22 μm有機濾膜，待測。

1.3.2 色譜檢測條件 Agilent 1200 高效液相色譜儀；CHIRALCEL OD-H (4.6 mm × 250 mm,5 μm) 手性柱；進樣量20 μL；流動相為V(正己烷) :V(異丙醇) = 98 : 2；流速1 mL/min；柱溫箱溫度為室溫；檢測波長230 nm。

1.4 數據處理

1.4.1 分離度 按公式 (1) 計算分離度 (R)。

式中，t1和t2分別代表峰1和峰2的保留時間；W1和W2分別代表峰1 和峰2在峰底的峰寬。當R≤1時表示兩峰有部分重疊；當1

1.4.2 一級動力學方程 按公式 (2) 和 (3) 采用指數回歸方程求降解半衰期（t1/2）。

式中，ct代表t時間的農藥殘留量；c0代表初始濃度；k代表降解速率常數 。

1.4.3 馬拉硫磷對映體選擇性降解測定 采用對映體分數 (EF值) 作為馬拉硫磷對映體選擇變化的指標，按公式 (4) 計算。

式中，A1代表先流出的對映體殘留量；A2代表后流出的對映體殘留量。EF值的范圍在0～1之間，當EF = 0.5時表示兩個對映體降解速率相同，沒有對映體選擇性。當EF<0.5和EF>0.5時均表明馬拉硫磷產生了立體選擇性降解，偏離的值越大，選擇性越明顯[15]。

2 結果與討論

2.1 對映體拆分方法的確定

試驗測試了使用手性色譜柱CHIRALCEL OD-H在不同流動相 (V(正己烷) :V(異丙醇)=90 :10、94 : 6和98 : 2) 以及不同定容溶劑 (異丙醇或正己烷) 下馬拉硫磷兩個對映異構體的拆分情況。結果 (表1) 顯示，在3種流動相比例條件下，只有當V(正己烷) :V(異丙醇) = 98 : 2時實現了兩峰的基線分離，且正己烷定容的分離度大于異丙醇，因此，最終選擇V(正己烷) :V(異丙醇) =98 : 2作為流動相，定容溶劑選擇正己烷。

表1 馬拉硫磷在不同條件下的拆分Table 1 The chromatographic separation of malathion under different conditions

2.2 對映體旋光性分析

在1.3.2節檢測條件下，先流出對映體的旋光度為右旋 (+)，后流出對映體的旋光度為左旋 (?)，其紫外和旋光圖如圖1所示。本研究拆分條件與Sun[11]的基本一致，可以確定先流出的異構體構型為R-(+)-馬拉硫磷，后流出的為S-(?)-馬拉硫磷。

2.3 分析方法確證

按1.3節的方法進行1、50和150 mg/kg 3個水平的添加回收試驗。結果顯示：馬拉硫磷R-對映體的平均回收率在84%～90%之間，RSD在1.5%～19%之間；S-對映體的平均回收率在81%～90%之間，RSD在2.0%～11%之間。在0.5～500 mg/L范圍內，馬拉硫磷的峰面積與其質量濃度間呈良好線性關系，R-對映體的線性方程為y= 3.860 6x+2.490 5，R2= 0.999 9；S-對映體的線性方程為y=3.865 1x+ 1.769 0，R2= 1.000 0。所建方法可以準確對MRS培養基中的馬拉硫磷進行定量。

2.4 乳酸菌增殖情況及pH值變化

結果 (圖2) 表明，4種乳酸菌在0～24 h內的生長速度最快，于36 h時達到最大值，之后逐漸保持穩定；穩定后，干酪乳桿菌0.5%接菌量的處理，其菌液濃度略高于5.0%接菌量的處理，其他3種乳酸菌5.0%接菌量的處理，其菌液濃度略高于0.5%接菌量接菌量的處理。表明乳酸菌的對數生長階段是在前48 h。此后，乳酸菌菌量保持穩定，進入穩定生長階段。

本研究同時對培養基pH值進行了測定。結果表明，4種乳酸菌在0～24 h內pH值從7降到5，之后維持在5不變；對照組 (接菌量0%) 的pH值穩定在7。

2.5 馬拉硫磷對映異構體的選擇性降解

馬拉硫磷對映異構體的降解符合一級反應動力學方程。由 (表2) 數據可以看出：隨培養時間延長兩個對映異構體呈穩定降解趨勢。對照組中，R-馬拉硫磷的半衰期在4.0～6.0 d之間，S-馬拉硫磷的半衰期在3.9～5.6 d之間；處理組中，R-馬拉硫磷的半衰期在5.4～6.5 d之間，S-馬拉硫磷的半衰期在5.1～6.3 d之間。處理組和對照組間半衰期無明顯差異，表明乳酸菌對馬拉硫磷降解沒有明顯影響。

表2 馬拉硫磷對映體的降解方程、相關系數和半衰期 (n = 3)Table 2 The degradation equation, correlation coefficient (r), and halflives of malathion enantiomers in culture medium (n = 3)

4種乳酸菌不同接菌量的EF值變化曲線如圖3所示。在開始取點時 (0 h) 對照組和乳酸菌處理組的EF值均接近0.50。經過12 d培養后，兩個對映異構體的EF值均保持在0.50左右，R-對映體和S-對映體半衰期的比值在0.98～1.07之間。處理組中乳酸菌種類、接菌量等因素對兩個對映體的降解無明顯影響，表明4種乳酸菌對馬拉硫磷沒有立體選擇性降解作用。與前人研究結果[6]相比，本文側重點在于對農藥異構體選擇性降解的分析，且對不同乳酸菌菌株和接菌量的影響分別進行研究。

3 結論

建立并優化了MRS培養基中馬拉硫磷兩個對映異構體提取和高效液相色譜分析方法，經方法的有效性檢驗證明，本方法準確度、精密度和線性范圍均滿足檢測要求。通過向MRS培養基中添加馬拉硫磷外消旋體的方式，將植物乳桿菌、干酪乳桿菌、保加利亞桿菌和嗜熱鏈球菌4種乳酸菌以不同接菌量接種，通過不同培養時間采樣測定乳酸菌的活性和pH值變化情況，以及對馬拉硫磷對映體降解的影響。結果表明，在本試驗條件下，4種乳酸菌均不會加速馬拉硫磷的降解，并且不同菌種、接菌量和乳酸菌活性等因素均不會對馬拉硫磷產生立體選擇性降解。馬拉硫磷兩個對映體在乳酸菌處理組和對照組中的降解速率相近，不產生立體選擇性降解。該研究結果為乳酸菌發酵制品中手性農藥殘留膳食攝入風險評估的完善提供了數據支持，可為未來開展相關領域的研究提供方法學借鑒和參考。