RNA結合蛋白Musashi2與宮頸鱗狀細胞癌關系的研究

甄娟，劉玉東，宋春紅△，吳莎，畢學杰

宮頸癌是全球女性第4大常見的癌癥［1］，是世界范圍內女性因癌癥死亡的第4 大原因［2］。宮頸癌最常見的病理類型是鱗狀細胞癌，且幾乎所有的宮頸鱗狀細胞癌與人乳頭瘤病毒（HPV）感染有關。研究顯示，盡管使用了先進的篩查手段、注射HPV疫苗，但仍有50%以上宮頸鱗狀細胞癌患者被確診時已為晚期，此時治療選擇有限且預后較差，5年生存率僅16.8%［3］。因此，尋求有效的腫瘤標志物對晚期宮頸鱗狀細胞癌患者的靶向治療及預后評估至關重要。近來研究發現，RNA 結合蛋白Musashi2（MSI2）與腫瘤的惡性生物學行為關系密切，是一個潛在的癌癥治療靶點［4］。系列研究顯示，MSI2 在卵巢癌［5-6］、食管癌［7］、胃癌［8］、結腸癌［9］、前列腺癌［10］及膠質母細胞瘤［11］中均呈高表達狀態。然而，鮮見有關MSI2在宮頸鱗狀細胞癌中的研究。本研究通過檢測MSI2 在宮頸鱗狀細胞癌中的表達情況，分析MSI2與患者預后的關系，以期為宮頸鱗狀細胞癌的治療和預后評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012 年1 月—2019 年1 月于石家莊市第四醫院婦科就診并行陰道鏡活檢和宮頸癌手術切除的226例患者標本，包括癌旁正常宮頸組織40例，高級別鱗狀上皮內病變組織60例，宮頸鱗狀細胞癌組織126例。所有患者術前均未接受放化療及其他治療。患者年齡25～82歲，中位年齡50（46，57）歲，分別由2 名主治及以上病理醫師根據2014第4版世界衛生組織（WHO）宮頸腫瘤分類標準和2018國際婦產科聯盟（FIGO）分期系統確定腫瘤的組織學類型以及手術病理分期。126 例宮頸鱗狀細胞癌患者均行全面分期手術，其中FIGOⅠ+Ⅱ期患者78 例，FIGOⅢ+Ⅳ期患者48 例。術中同時留取宮頸鱗狀細胞癌及癌旁正常宮頸組織（經形態學證實為正常宮頸組織，無病變殘留），組織離體后取少量組織立即放入液氮，然后移入-80 ℃冰箱保存。所有標本的使用均通過本院倫理委員會審核，患者本人均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 免疫組化SP法試劑盒、磷酸鹽緩沖液（PBS）及DAB 顯色試劑均購自福州邁新公司，兔抗人MSI2 抗體購自美國abcam公司，β-actin抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學SP染色檢測MSI2蛋白表達變化 所有組織經中性福爾馬林固定、石蠟包埋，制成4 μm 厚連續切片。按照SP 試劑盒說明書染色，MSI2 抗體以1∶400 稀釋，PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性片作陽性對照。結果判定：染色結果由2名有經驗的中級以上病理科醫師閱片審核，陽性顯色為細胞質及部分細胞核中出現棕黃色顆粒。每張切片隨機讀取5 個高倍視野（×400），每個視野計數200個瘤細胞。按陽性細胞百分比計分：無陽性細胞計0分，陽性細胞≤10%計1分，11%～50%計2分，51%～80%計3分，＞80%計4分。按細胞著色強度計分：無陽性著色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，黃褐色計3分。將上述兩項計分相乘：＜3分為陰性，≥3分為陽性［12］。

1.3.2 Western blot法檢測MSI2蛋白表達情況 收集新鮮宮頸組織，加入裂解液剪碎勻漿，4 ℃15 000 r/min離心30 min，取上清液為總蛋白，Bradford法測定細胞提取物的蛋白濃度，去除因蛋白降解等原因導致蛋白濃度過低的標本，30例宮頸鱗狀細胞癌及30例癌旁正常宮頸組織進行聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠電泳、恒壓轉印，脫脂奶粉封閉，抗MSI2（1∶800）、抗β-actin（1∶200）4 ℃孵育過夜，與相應二抗室溫下孵育2 h，ECL發光。Image J（V1.8.0）軟件半定量分析特異性條帶的光密度（OD）值，將目的蛋白與β-actin 的OD 值之比作為目的蛋白相對表達量。

1.4 隨訪 126例宮頸鱗狀細胞癌患者術后每6個月進行1次隨訪，采用患者門診復查及醫生電話隨訪方式。接受手術的時間為開始時間，隨訪截止日期為2020年12月31日。患者死亡為結局事件，中途失訪者、死于其他疾病為截尾數據（刪失值）。

1.5 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以表示，組間比較用t檢驗。計數資料比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，Log-rankχ2檢驗比較組間累積總生存率（overall survival，OS）的差異。Cox比例風險模型篩選宮頸鱗狀細胞癌患者預后的獨立預測因素。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 宮頸組織中MSI2 陽性表達情況及與相關病理參數的關系 MSI2陽性表達主要定位于細胞漿，見圖1。在正常宮頸組織、高級別鱗狀上皮內病變組織及宮頸鱗狀細胞癌組織中陽性表達率逐漸升高，分別為7.50%（3/40）、28.33%（17/60）及61.90%（78/126），差異有統計學意義（χ2=44.104，P＜0.05）。FIGOⅢ+Ⅳ期、有淋巴結轉移、HPV16感染及Ki67高表達者MSI2陽性率更高（均P＜0.05），見表1。

Fig.1 The expression of MSI2 in cervical tissues(SP,×100)圖1 MSI2在宮頸組織中的表達（SP，×100）

Tab.1 The relationship between the positive expression of MSI2 and the different clinicopathologic parameters of cervical squamous cell carcinoma表1 宮頸鱗狀細胞癌的臨床病理學參數與MSI2陽性表達間的關系 ［例（%）］

2.2 宮頸組織中的MSI2 蛋白表達水平 宮頸鱗狀細胞癌組織中的MSI2 相對表達量高于癌旁正常宮頸組織（0.80±0.09vs.0.24±0.06；n=30，t=19.424，P＜0.05），見圖2。

Fig.2 The amount of expression of MSI2 in cervical tissues圖2 MSI2在宮頸組織中的表達量

2.3 宮頸鱗狀細胞癌MSI2 陽性表達患者5 年累積生存率分析 以126例宮頸鱗狀細胞癌患者的臨床病理參數中MSI2 陽性表達差異有統計學意義的參數進行生存分析，結果顯示，MSI2陰性表達者、FIGOⅠ+Ⅱ分期、無淋巴結轉移者中位生存時間較長（均P＜0.05），見圖3、表2。

Fig.3 The cumulative survival rates of patients with different expression of MSI2,FIGO stage and lymph node metastasis in cervical squamous-cell carcinoma(Kaplan-Meier)圖3 宮頸鱗狀細胞癌不同MSI2表達、FIGO分期及淋巴結轉移者累積生存率情況（Kaplan-Meier法）

Tab.2 Univariate analysis of cumulative survival rate in patients with cervical squamous cell carcinoma表2 宮頸鱗狀細胞癌患者累積生存率的單因素分析

2.4 宮頸鱗狀細胞癌患者術后生存資料的多因素Cox 回歸分析 將 MSI2（陰性=0，陽性=1）、FIGO 分期（Ⅰ+Ⅱ=0，Ⅲ+Ⅳ=1）、淋巴結轉移（無=0，有=1）、HPV16（陰性=0，陽性=1）和 Ki67（低表達=0，高表達=1）作為自變量，以生存結局（生存=0，死亡=1）為因變量進行Cox回歸分析顯示，MSI2陽性、FIGOⅢ+Ⅳ期和淋巴結轉移均是宮頸鱗狀細胞癌患者生存的危險因素（均P＜0.05），見表3。

Tab.3 Multivariate Cox regression analysis of postoperative cumulative survival data in patients of cervical squamous cell carcinoma表3 宮頸鱗狀細胞癌患者術后生存資料的多因素Cox回歸分析

3 討論

目前，有關宮頸癌致病相關的基因位點的研究是期望在分子水平上對宮頸癌進行干預［13］。MSI2基因位于人染色體17q23.2，編碼328 個氨基酸，其編碼蛋白MSI2 具有2 個剪接體形式（MSI2L 和MSI2S），分子質量分別為 36.9 ku 和 35.7 ku［14］。MSI2基因的易位和缺失可導致慢性粒細胞性白血病、急性髓系白血病和某些急性淋巴性白血病的發生，并且MSI2 蛋白在多種惡性腫瘤中高表達［15］。有研究顯示，晚期卵巢癌組織中MSI2 的表達明顯高于早期卵巢癌組織，過表達MSI2 可使卵巢癌細胞活性、腫瘤細胞增殖能力和生長速率明顯增加［5］。Guo 等［16］研究發現，過表達MSI2 能夠促進體內和體外胰腺導管癌細胞的生長、侵襲以及肝轉移，敲低MSI2 后出現與之相反的結果。食管癌組織中MSI2 也呈高表達，并且其高表達與腫瘤的增殖侵襲和轉移惡性生物學行為關系密切［7］。本研究結果顯示，MSI2 蛋白在宮頸鱗狀細胞癌組織中的表達量顯著高于癌旁正常宮頸組織，其陽性表達率在正常宮頸組織、高級別鱗狀上皮內病變、宮頸鱗狀細胞癌組織中依次升高，并且HPV16 感染者MSI2 陽性率更高，表明MSI2 與宮頸鱗狀細胞癌發生有關；另外，MSI2 表達與FIGO 分期、淋巴結轉移及Ki67 關系密切，FIGOⅢ+Ⅳ期、淋巴結轉移及細胞增殖標志物Ki67 高表達者MSI2 陽性率更高，表明MSI2 與宮頸鱗狀細胞癌的進展以及淋巴結轉移有關，筆者推測可能與其他惡性腫瘤相似，MSI2 在宮頸鱗狀細胞癌中作為腫瘤促進因子發揮生物學作用，有望成為宮頸鱗狀細胞癌發生和進展的分子標志物。

近年來研究發現，卵巢癌細胞對紫杉醇的敏感性和耐藥性受MSI2 蛋白的調節，抑制MSI2 的表達可增強卵巢癌細胞對紫杉醇藥物的敏感性，增強紫杉醇介導的細胞凋亡，而過表達MSI2能導致卵巢癌細胞對紫杉醇藥物的抵抗［6］。另外，MSI2 的過表達與食管癌［7］、胃癌［8］、急性髓系白血病［17］患者的不良預后關系密切。因此，MSI2在惡性腫瘤的治療和預后評估中可發揮一定的作用。本研究生存分析發現，MSI2 陰性表達者、FIGOⅠ+Ⅱ分期、無淋巴結轉移者生存質量較高，與MSI2 陰性表達患者相比，MSI2陽性表達者的累積總生存率下降，中位生存時間顯著縮短，多因素Cox 回歸分析發現MSI2 陽性是宮頸鱗狀細胞癌患者的危險因素，表明MSI2與宮頸鱗狀細胞癌患者預后關系密切，MSI2陽性表達提示患者預后不良，MSI2可作為臨床評估宮頸鱗狀細胞癌患者預后的參考指標。

綜上所述，MSI2在宮頸鱗狀細胞癌中呈高表達并且與腫瘤惡性生物學行為及患者預后關系密切，MSI2 具有成為宮頸鱗狀細胞癌診斷標志物和臨床治療靶點的潛在可能，可以幫助臨床評估患者的預后。