Wnt1誘導信號通路蛋白1在胃腺癌中的表達及其意義

董學易，趙秀蘭，趙楠，張丹芳，李巖磊，孫保存，2△

胃癌是全球范圍內癌癥死亡的第3 大原因，早發現、早診治對于預后至關重要，但多數胃癌患者就診時已是中晚期，5年生存率不到10%。胃腺癌是胃癌中最常見的一個類型，其容易復發和轉移的特性給臨床治療帶來了巨大挑戰［1］。Wnt1誘導信號通路蛋白1（WISP1）是細胞通訊網絡（CCN）蛋白家族中的一員，是一種富含半胱氨酸的分泌型細胞外基質相關蛋白［2］。研究發現，WISP1 作為經典 Wnt/βcatien 通路的靶蛋白，參與腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移［3］。目前關于WISP1 在胃腺癌中的作用及其機制尚不完全清楚。本研究通過收集的臨床胃腺癌樣本，結合癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫和GEO數據庫中的胃腺癌數據集，綜合分析WISP1 在胃腺癌中表達及其與預后的關系，以期為臨床診療提供新思路和潛在靶點。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集天津醫科大學腫瘤醫院2001年1月—2008 年7 月經手術切除的胃腺癌標本200 例，所有患者術前均未經過放化療，由2位有經驗的病理醫師重新閱片確診為胃腺癌。200例患者中男138例，女62例，年齡28～82歲，平均（60.63±11.52）歲；發生淋巴結轉移126 例；有復發和（或）遠處轉移103例。

1.2 實驗材料 兔抗WISP1 抗體（Abcam 公司，ab178547），兔抗血管內皮生長因子（VEGF）抗體（Santa-cruse 公司，SC-7269），兔抗Twist1 抗體（Santa-cruse 公司，SC-81417），兔抗基質金屬蛋白酶（MMP）-2 抗體（Proteintech 公司，10373-2-AP），兔二抗工作液（PV-6001）、封閉用山羊血清（ZLI-9022）均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 免疫組化染色 石蠟切片（厚度5 μm）采用PV 二步法進行免疫組化染色。切片經二甲苯脫蠟后，用3%無水甲醇過氧化氫封閉內源性過氧化物酶，梯度乙醇水化，枸櫞酸抗原修復液（pH=6.0）修復10～12 min。于山羊血清室溫封閉30 min，滴加 WISP1（1∶600），VEGF（1∶100），Twist1（1∶100），MMP-2（1∶400）一抗于4 ℃孵育過夜。次日恢復室溫1 h，滴加兔二抗孵育1 h后，3，3-二氨基聯苯胺顯色10 min，自來水沖洗，蘇木素復染細胞核2 min，流水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。WISP1 陽性對照選取人胎盤組織，VEGF陽性對照選取人甲狀腺組織，Twist1陽性對照選取人肝癌組織，MMP-2 陽性對照選取人神經膠質瘤組織，用PBS 代替一抗作為陰性對照。免疫組化結果判讀采用Mattern積分法［4］，每張切片于高倍（×400）顯微鏡下隨機讀取5 個視野，計數100 個腫瘤細胞/視野。根據腫瘤細胞的陽性細胞百分率和染色強度評價染色效果。陽性細胞百分率：陽性腫瘤細胞數＜25%記0分，25%～50%記1分，51%～74%記2分，≥75%記3分。染色強度評分：無色記0分，淺黃色記1分，深黃色記2 分，棕黃色或褐色記3 分。兩者得分乘積為總評分，≥3分陽性，＜3分為陰性。

1.4 數據庫信息分析WISP1 表達 利用GEPIA（Gene Expression profiling interactive analysis，http://gepia. cancerpku.cn/）［5］和UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/）在線工具［6］中的表達模塊分析TCGA 數據庫中胃腺癌數據集（TCGASTAD）中WISP1 的表達水平。其中GEPIA 在線工具表達模塊中收錄408 例胃腺癌組織、36 例癌旁組織和175 例正常胃組織。UALCAN在線工具表達模塊中收錄415例胃腺癌組織和34例癌旁組織。從美國國家生物技術信息中心（NCBI）的GEO 數據庫中獲得GSE13861 胃腺癌數據集，該數據集包含65 例胃腺癌組織和19 例癌旁組織。基于compare_means 函數進行t檢驗，通過“ggpubr”R包中的ggviolin進行結果可視化。

1.5 預后分析 針對本中心胃腺癌標本和TCGA-STAD 數據集分析WISP1 與預后的關系。對隨訪的200 例人體胃腺癌標本進行Kaplan-Meier 生存分析，比較WISP1陽性表達組和陰性表達組患者生存時間的差異；并用GEPIA和UALCAN在線工具的生存分析模塊驗證TCGA-STAD 數據集中患者WISP1表達水平與生存率的關系。

1.6 WISP1 表達與上皮間充質轉化（EMT）和血管生成相關基因的相關性分析 利用人體胃腺癌免疫組化檢測和TCGA-STAD 數據集分析 WISP1 與 EMT 相關基因（Twist1、Snail、Vimentin 和 CDH1）和血管生成相關基因（VEGF、CDH5、MMP-2和MMP-9）的關系。利用“TCGAbiolinks”R包下載TCGA-STAD 基因表達矩陣，分析WISP1與EMT相關基因和血管生成相關基因的相關性。

1.7 差異基因富集分析 基于WISP1 表達的中位數，將TCGA-STAD數據集和GSE13861中的樣本分為WISP1高、低表達組。利用“limma”R包進行差異分析，對TCGA-STAD 數據集進行基因本體（GO）功能分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。從生物學過程（biological process，BP）、細胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）3 個層面進行GO 分析。此外，利用基因集富集分析（GSEA）軟件［7］對TCGA-STAD 和GSE13861分別進行基因集富集分析。

1.8 統計學方法 基于SSPS 16.0軟件和R軟件（3.6.1版本）進行數據分析。計數資料的比較用四格表χ2檢驗。計量資料的比較采用2獨立樣本比較的t檢驗。患者生存預后的差異比較采用Kaplan-Meier 生存分析法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 WISP1 在胃腺癌中的表達 免疫組化染色結果顯示，WISP1主要定位于胃腺癌細胞漿，呈棕黃色顆粒狀（圖1）。200 例胃腺癌組織中WISP1 陽性表達116例（58%），陰性表達84例（42%）。

Fig.1 The WISP1 expression levels in stomach adenocarcinoma(immunohistochemistry staining,×200)圖1 WISP1蛋白在胃腺癌組織中的表達水平（免疫組化染色，×200）

2.2 WISP1 與胃腺癌臨床病理特征的關系 不同年齡、性別、腫瘤直徑和組織分化程度患者WISP1表達陽性率差異無統計學意義。TNM Ⅲ～Ⅳ期患者WISP1表達陽性率高于Ⅰ～Ⅱ期者，有淋巴轉移患者高于無淋巴結轉移者，有遠處轉移和（或）復發患者高于無遠處轉移或復發者（均P＜0.05），見表1。TCGASTAD數據集和GSE13861分析結果均顯示WISP1在胃腺癌中的表達水平高于對照組，見圖2A～D。胃腺癌高分期患者WISP1表達較高，見圖2E、F。

Tab.1 The difference of positive WISP1 expression in gastric adenocarcinoma patients with different clinicopathological parameters表1 不同臨床病理特征的胃腺癌患者WISP1表達陽性率的差異 ［例（%）］

2.3 生存預后分析 Kaplan-Meier生存分析結果表明，WISP1 陽性表達患者的中位生存時間短于WISP1 陰性表達患者（24 個月vs.52 個月，Log-rankχ2=5.368，P＜0.05），見 圖 3A。 同 時 GEPIA 和UALCAN 分析STAD 數據集的結果與此相一致（GEPIA：25 個月vs.49 個月，P＜0.05；UALCAN：25個月vs.48個月，P＜0.05），見圖3B、C。

Fig.3 Survival curves of stomach adenocarcinoma with high and low expression of WISP1圖3 WISP1高表達和低表達胃腺癌患者生存曲線

2.4 WISP1 與 VEGF、Twist1 和 MMP-2 蛋白表達的關系 VEGF、Twist1 和 MMP-2 蛋白表達于胃腺癌細胞漿內，見圖 4。VEGF、Twist1 和 MMP-2 的表達和WISP1陽性表達具有一定程度的關聯（P＜0.05），見表2。

Fig.4 The expression levels of VEGF,Twist1 and MMP-2 in gastric adenocarcinoma(immunohistochemistry staining,×200)圖4 VEGF，Twist1和MMP-2蛋白在胃腺癌組織中的表達水平（免疫組化染色，×200）

Tab.2 Expression levels of VEGF,Twist1 and MMP-2 in high and low WISP1 expression groups表2 VEGF，Twist1和MMP-2在WISP1陽性組和陰性組間表達的比較 ［例（%）］

2.5 WISP1 與血管生成和EMT 相關基因的相關性 利用TCGA-STAD 數據集進行的相關性分析結果顯示：WISP1 與 VEGF、CDH5、MMP-2、MMP-9、Twist1、Snail 和 Vimentin 呈正相關（r分別為 0.64、0.49、0.64、0.32、0.49、0.43、0.64，均P＜0.05），與CDH1呈負相關（r=-0.25，P＜0.05）。

2.6 WISP1 基因GO 功能分析和KEGG 通路富集分析 按WISP1 表達水平中位數，將TCGA-STAD 數據集分為高、低2 組，并進行差異基因的富集分析。結果顯示，WISP1基因參與單核細胞遷移、細胞外基質（ECM）構造和細胞間黏附等生物過程，具有與整合素和膠原結合及細胞因子激活的分子功能（圖5A～C）。同時KEGG通路富集分析結果表明，WISP1參與ECM結合和細胞黏附的信號傳導通路（圖5D）。

Fig.5 Gene Ontology analysis and KEGG pathway analysis圖5 GO功能分析和KEGG通路富集分析

2.7 GSEA富集分析 將GSE13861和TCGA-STAD數據集進行WISP1 高、低表達分組后進行GSEA 分析，結果表明在TCGA和GEO數據庫中，當WISP1高表達時，血管生成和EMT 的相關基因上調，高表達的WISP1與血管生成和EMT的發生有關，見圖6。

Fig.6 GSEA enrichment analysis of WISP1 and angiogenesis pathway and EMT pathway in TCGA database and GSE13861 dataset圖6 TCGA數據庫和GSE13861數據集中WISP與血管生成通路和EMT通路富集分析

3 討論

WISP1 是 Hashimoto 等［8］在研究黑色素瘤細胞時發現的分泌型細胞外基質相關蛋白。現已表明WISP1在口腔鱗癌［9］、胰腺導管腺癌［10］、乳腺癌［11］等腫瘤中高表達，并促進癌細胞的生長與轉移，與患者的生存預后密切相關。本研究從蛋白和基因層面，通過對人胃腺癌標本、TCGA-STAD 數據集和GEO數據庫中GSE13861 數據集分析等多種方法證實，WISP1 在胃腺癌中的表達高于癌旁組織，在胃腺癌高表達者更容易發生復發和轉移，同時生存率明顯下降。

Folkman［12］認為腫瘤的生長依賴血管為其提供營養，并且腫瘤的血管生成在其轉移和復發過程中起了重要作用。VEGF 可以誘導腫瘤血管生成［13］。基質金屬蛋白酶（MMPs）可通過降解細胞外基質而促進腫瘤轉移，其中MMP-2可降解基底膜和Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ型膠原以及溶解明膠［14］。MMP-9能夠水解細胞外基質和基底膜的主要成分Ⅳ型膠原、Ⅴ型膠原、黏連蛋白等，并且MMP-2和MMP-9可以協助VEGF發揮誘導腫瘤血管生成的作用［15］。CDH5是一種表達于內皮細胞之間的黏附分子，在維持血管完整性、調控內皮細胞連接和血管的形成中起著重要的作用［16］。本研究中，免疫組化染色結果表明，VEGF、MMP-2 和WISP1 的表達具有一定程度的關聯，在WISP1 高表達組中伴隨VEGF 和MMP-2 的高表達。TCGA-STAD 數據集相關分析說明WISP1 表達與VEGF、CDH5、MMP-2 和 MMP-9 呈正相關。另外WISP1 的GO 功能分析和KEGG 通路差異基因富集分析證實，WISP1 參與細胞外基質的構造過程。同時GSEA 富集實驗結果表明，WISP1 高表達與血管發生相關。綜合這些結果表明，WISP1 可能具有促進胃腺癌血管生成的潛力。

EMT即上皮性來源的細胞失去原有表型而獲得間充質表型，并經歷細胞骨架重塑的過程。EMT 的細胞標志事件是細胞中E-cadherin（CDH1）等黏附蛋白表達降低，導致細胞間的橋粒連接減弱，同時伴有間充質特性的標志物Vimentin 等表達增加，細胞的遷移能力增加。其中Twist1 和Snail 是啟動組織發生EMT 的重要轉錄因子。本研究中免疫組化染色結果證實，Twist1和WISP1表達具有一定關聯，并且對TCGA-STAD 數據集的分析顯示，WISP1 表達水平與 Twist1、Snail 和 Vimentin 呈正相關，與 CDH1呈負相關；另外WISP1的GO功能分析和KEGG通路差異基因富集分析證實，WISP1 參與細胞黏附功能和單核細胞的遷移過程；同時GSEA 富集實驗結果表明，WISP1 高表達與EMT 發生相關。筆者推測WISP1 可能通過EMT 過程促進胃腺癌的轉移。Jia等［17］研究證實，WISP1可使胃癌細胞發生EMT，促進胃癌細胞增殖、轉移和侵襲。本課題組前期研究亦證實，EMT參與胃癌血管生成擬態過程，而血管生成擬態是胃癌發生轉移的重要環節之一［16］。上述結果為WISP1促進胃腺癌發生轉移和侵襲提供了更有力的證據。

綜上所述，WISP1在胃腺癌組織中高表達，并且在淋巴結轉移，遠處轉移和（或）復發的胃腺癌組織中高表達，高表達的WISP1患者生存預后差；WISP1可通過促進胃腺癌的血管生成和啟動胃腺癌細胞發生EMT，促使胃腺癌發生轉移。WISP1 通過多個途徑發揮作用，最終導致胃腺癌患者發生不良的預后。然而，關于WISP1 在胃腺癌中如何調控VEGF、Twist1、MMP-2 的表達以及相關通路的相互作用還需進一步研究。