LTBP2通過TLR4/NF-κB信號通路抑制糖尿病大鼠海馬神經元凋亡

欒寧，劉丹，劉暢，王新楊，侯陽，張曉妍△

隨著糖尿病病程的延長，患者會出現學習記憶能力下降［1-2］，這與血糖控制不良有直接關系［3］。此外，糖尿病通常會增加患者癡呆的發病率［4］；也會導致海馬神經元受損，包括細胞凋亡，進而引起認知障礙和記憶喪失［5］。研究發現，神經元凋亡與炎癥、氧化應激聯系緊密［6］。潛在轉化生長因子β結合蛋白2（latent transforming growth factor beta binding protein2，LTBP2）屬于細胞外基質蛋白家族的一員，與多種疾病中炎癥、氧化應激形成有關［7-8］。但是，LTBP2 對糖尿病認知功能障礙的影響尚鮮見報道。本研究擬探討LTBP2及其轉導通路對糖尿病大鼠學習記憶的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性SD 大鼠60 只，體質量180～220 g，購自錦州醫科大學，動物生產許可證編號：SCXK（遼）2019-16。

1.1.2 試劑及儀器 鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，Sigma）；LTBP2、Toll樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4）、核轉錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、GAPDH 一抗（英國Abcam公司）；免疫組化試劑盒、TUNEL染色試劑盒、Western blot二抗、RNA提取試劑盒、反轉錄試劑及PCR試劑（北京碧云天公司）。正置顯微鏡（日本Olympus 公司），石蠟切片機（德國SLEE 公司），水平電泳儀、熒光定量PCR 儀（BIORAD），Morris 水迷宮（玉研儀器公司）。si-LTBP2 由上海吉瑪公司設計合成，其反義寡核苷酸序列為5'-CCGCAACAACGCCAUCUAUTT-3'，對 照 序 列 為 5'-AUAGAUGGCGUUGUUGCGGTT-3'。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制備 45只大鼠腹腔一次性注射STZ 55 mg/kg，72 h后采尾靜脈血測血糖，將血糖＞16.7 mmol/L的大鼠定為糖尿病模型，成模率為100%。模型誘導成功后，應用隨機數字表法將大鼠分成3 組：糖尿病（DM）組、si-LTBP2組（大鼠海馬給予腺病毒包裝的針對LTBP2的siRNA 10 μL）、sc-LTBP2組（大鼠海馬給予LTBP2對照序列10 μL），每組15只。另取15 只正常大鼠作為對照（CON）組。CON 組和DM組給予等劑量生理鹽水。常規飼養，環境溫度為20～25 ℃，濕度為50%～70%。腦立體定位注射：根據大鼠腦圖譜定位海馬部位進行微量注射，給藥劑量為10 μL。12周后進行各項指標檢測。實驗遵循國家《實驗動物管理條例》。

1.2.2 水迷宮檢測 12周后，每組應用隨機數字表法取5只大鼠，進行定位航行和空間探索實驗。（1）定位航行實驗：大鼠依次從水池的4個象限入水，大鼠登上平臺并維持2 s 后，計時停止并記為逃避潛伏期。大鼠登上平臺后，使其停留于平臺15 s以增強其學習記憶，擦干后放在溫暖環境中。如60 s內未登上平臺，則進行人工引導。第1～3 天，平臺置于液面上約1 cm；第4～5 天，平臺置于液面下約1 cm。（2）空間探索實驗：將平臺移去，每只鼠從原平臺所在象限的對側象限入水，記錄60 s內小鼠的游泳速度、在原平臺區域所處的時間。目標象限停留時間百分比=目標象限內游泳時間/總游泳時間×100%。

1.2.3 取材 隨機數字表法每組取5 只大鼠，以2%戊巴比妥鈉麻醉，4%多聚甲醛灌注固定后取出海馬，石蠟包埋切片，厚度為5 μm，用于免疫組化及TUNEL 染色。每組隨機取5 只大鼠，深度麻醉后取出海馬，提取總RNA，定量后于-80 ℃保存，用于實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qPCR）。每組剩余的5 只大鼠深度麻醉，處死后取海馬，冰上剪碎，裂解，冰上靜置30 min后4 ℃、12 000 r/min離心25 min，留上清液。BCA法測蛋白濃度并制樣，-20 ℃保存用于Western blot。

1.2.4 免疫組化檢測大鼠海馬LTBP2 表達 經1.2.3 制備的切片于PBS洗滌3次，每次5 min；切片置于體積分數3%H2O2室溫10 min，PBS洗滌3次，每次3 min；3%山羊血清室溫孵育30 min；不洗，滴加兔抗大鼠LTBP2（1∶400），4 ℃過夜；PBS洗滌3 次，每次3 min；滴加二抗，室溫30 min；PBS 洗滌3 次，每次3 min；滴加鏈霉親和素-生物素復合物（streptavidin-biotin complex，SABC）試劑，室溫30 min；PBS洗滌3次，每次3 min；二氨基聯苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）顯色，復染、脫水、透明封片后熒光顯微鏡拍照，并應用Image J 軟件分析同視野下LTBP2陽性細胞與總細胞數的比值作為表達陽性率。

1.2.5 qPCR 檢測海馬LTBP2 mRNA 表達變化 取1 μg RNA，按照反轉錄試劑盒說明書將RNA 反轉錄為cDNA。反轉錄條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。PCR循環參數：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40 個循環。每個樣本重復 3 次。結果為Ct值。以GAPDH為內參照，對目標基因進行歸一化處理，并應用2-ΔΔCt法來比較每組各個部位樣品中LTBP2 mRNA 的表達差異。LTBP2 引物應用DNASTAR 軟件設計，由上海吉瑪公司合成，引物序列為：上游5'-GGACGCGGAGTGTGTGAATACC-3'，下游 5'-GGGTAGCAGAAGGCAGGAGTAGG-3'。GAPDH 引物序列為：上游5'-TCCTGCACCACCAACTGCTTAG-3'，下游5'-AGTGGCAGTGATGGCATGGACT-3'。

1.2.6 Western blot 檢測LTBP2、TLR4、NF-κB 蛋白相對表達量 取1.2.3制備的上清液，BCA 法測定蛋白濃度，電泳時加入12 μL 樣品；電泳、轉膜后1%BSA 室溫封閉2 h；加入一抗（兔抗大鼠LTBP2，1∶2 000；兔抗大鼠TLR4，1∶5 000；兔抗大鼠NF-κB，1∶8 000；兔抗大鼠GAPDH，1∶5 000），4 ℃孵育過夜；TBST 洗滌 4 次，每次 5 min；加入二抗室溫 2 h，孵育后TBST 洗滌4 次，每次5 min；化學發光法ECL 顯影，Image J 軟件分析灰度值。

1.2.7 TUNEL 染色檢測各組大鼠海馬神經元凋亡 經1.2.3制備的切片脫蠟，PBS 洗3 次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗 3 次，加入含 0.1%Triton X-100 的 PBS 冰浴孵育 2 min，配制TUNEL 檢測液，TUNEL 檢測液按照末端脫氧核苷酸轉移酶（terminal deoxyribonucleotidyl transferase，TdT）與熒光標記液=1∶24的體積配制，PBS 洗2次，樣品加50 μL TUNEL 檢測液，37 ℃孵育60 min，PBS洗3次，封片后熒光顯微鏡下拍照。計數TUNEL 陽性細胞，凋亡率=TUNEL 陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊時采用SNK-q檢驗進行多重比較，方差不齊時采用Games-Howell 法，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Morries 水迷宮檢測結果 定位航行實驗結果顯示，與 CON 組相比，DM 組、si-LTBP2 組和 sc-LTBP2組大鼠平均逃避潛伏期明顯縮短（P＜0.05）；與DM 組相比，si-LTBP2 組明顯延長（P＜0.05）。空間探索實驗結果顯示，與CON 組相比，DM 組、si-LTBP2 組和sc-LTBP2 組大鼠在目標象限停留的時間百分比明顯降低；與DM組相比，si-LTBP2組明顯增加（P＜0.05）。大鼠的運動軌跡見圖1，水迷宮檢測結果見表1。

Fig.1 Morris water maze trajectory of rats in the four groups圖1 4組大鼠水迷宮運動軌跡圖

Tab.1 The Morris water maze results of the latency of escape and the percentage of the residence time in the target quadrant of the four groups of rats表1 4組大鼠水迷宮逃避潛伏期及目標象限停留時間百分比檢測結果 （n=5，）

Tab.1 The Morris water maze results of the latency of escape and the percentage of the residence time in the target quadrant of the four groups of rats表1 4組大鼠水迷宮逃避潛伏期及目標象限停留時間百分比檢測結果 （n=5，）

＊＊P＜0.01；a與CON組比較，b與DM組比較，c與si-LTBP2組比較，P＜0.05

組別CON組DM組si-LTBP2組sc-LTBP2組F逃避潛伏期（s）52.92±1.61 26.77±1.16a 45.26±1.44ab 26.69±1.01ac 300.470＊＊目標象限停留時間百分比（%）22.41±2.27 12.67±0.66a 18.55±0.71ab 12.88±1.17ac 35.873＊＊

2.2 4組大鼠海馬LTBP2蛋白表達 免疫組織化學結果顯示，LTBP2 陽性表達主要分布于海馬區神經元細胞質，陽性信號呈棕黃色顆粒，見圖2。CON組、DM 組、si-LTBP2 組、sc-LTBP2 組 LTBP2 蛋白表達陽性率分別為 13.70%±0.94%、74.29%±1.93%、25.87%±1.38%和73.54%±1.74%（n=5，F=1 259.482，P＜0.01）。與CON組相比，DM組、si-LTBP2組和sc-LTBP2組大鼠海馬LTBP2蛋白表達明顯增加；與DM組相比，si-LTBP2 組LTBP2 蛋白表達明顯減少（P＜0.05）。

Fig.2 Immunohistochemical staining of LTBP2 protein in hippocampus of rats in the four groups(×400)圖2 4組大鼠海馬LTBP2蛋白免疫組化染色（×400）

2.3 qPCR檢測4組大鼠海馬LTBP2mRNA表達 4組LTBP2mRNA 表達水平分別為 1.00±0.00、7.31±0.13、2.98±0.15 和 7.27±0.10（n=5，F=2 400.370，P＜0.01）。與 CON 組相比，DM 組、si-LTBP2 組和 sc-LTBP2 組大鼠海馬LTBP2mRNA 表達水平明顯增加；而與DM組相比，si-LTBP2組LTBP2mRNA表達水平明顯減少（P＜0.05），見圖3。

Fig.3 Comparison of LTBP2 mRNA expression in hippocampus of rats between the four groups圖3 4組大鼠海馬LTBP2 mRNA表達量比較

2.4 Western blot 檢測海馬LTBP2、TLR4、NF-κB 蛋白相對表達量 與CON組相比，DM組、si-LTBP2組和sc-LTBP2 組大鼠海馬LTBP2、TLR4、NF-κB 蛋白表達水平明顯增加；而與DM 組相比，si-LTBP2 組LTBP2、TLR4、NF-κB 蛋白表達水平明顯減少（P＜0.01），見圖4、表2。

Fig.4 The relative expressions of LTBP2,TLR4 and NF-κB in hippocampus detected by Western blot assay圖4 Western blot檢測海馬LTBP2、TLR4、NF-κB蛋白相對表達量

Tab.2 Comparison of LTBP2,TLR4 and NF-κB protein expressions in hippocampus of rats between the four groups表2 4組大鼠海馬LTBP2、TLR4、NF-κB蛋白表達水平比較 （n=5，%，）

Tab.2 Comparison of LTBP2,TLR4 and NF-κB protein expressions in hippocampus of rats between the four groups表2 4組大鼠海馬LTBP2、TLR4、NF-κB蛋白表達水平比較 （n=5，%，）

＊＊P＜0.01，a與CON組比較，b與DM組比較，c與si-LTBP2組比較，P＜0.01

組別CON組DM組si-LTBP2組sc-LTBP2組F TLR4/GAPDH 15.44±1.09 140.92±3.35a 25.36±0.73ab 141.63±2.05ac 3 417.929＊＊NF-κB/GAPDH 20.55±1.13 123.20±2.33a 83.02±2.50ab 122.06±2.57ac 1 428.562＊＊LTBP2/GAPDH 17.38±0.99 118.59±2.13a 32.77±1.74ab 117.99±1.71ac 3 084.710＊＊

2.5 TUNEL 染色檢測海馬神經元凋亡 CON 組、DM 組、si-LTBP2 組、sc-LTBP2 組凋亡 率分別為2.83%±0.29%、64.03%±1.71%、17.14%±1.29% 和63.21%±1.29%（n=5，F=1 876.135，P＜0.01）。 與CON 組相比，DM 組、si-LTBP2 組和 sc-LTBP2 組大鼠海馬神經元細胞凋亡明顯增加，而與DM組相比，si-LTBP2組細胞凋亡明顯減少（P＜0.01），見圖5。

Fig.5 Apoptosis of hippocampus of rats detected by TUNEL staining in the four groups(×400)圖5 TUNEL染色檢測4組大鼠海馬細胞凋亡（×400）

3 討論

3.1 糖尿病海馬神經元凋亡誘導大鼠學習記憶能力下降 1型糖尿病（T1DM）和T2DM都會引起神經損傷并發癥，包括學習記憶功能障礙的風險增加。越來越多的動物模型證據表明，糖尿病在不同程度上損害了認知功能，包括學習、記憶和注意力，并增加了抑郁和焦慮的發病率［9-10］。隨著糖尿病患者癡呆風險增加，更加重了學習和記憶缺陷［11］。本研究發現，糖尿病大鼠在水迷宮實驗中平均逃避潛伏期明顯縮短，在目標象限停留的時間百分比明顯降低，說明糖尿病會引起大鼠學習記憶損傷。本研究還發現，糖尿病可誘導大鼠海馬神經元凋亡，TUNEL 陽性細胞明顯增多，這也在某種程度上加重了大鼠學習記憶障礙。以上結果表明，糖尿病可降低大鼠學習記憶能力，誘導神經元凋亡，這提示本實驗模型誘導成功。

3.2 LTBP2 可介導糖尿病大鼠學習記憶功能障礙 研究發現，神經炎癥在糖尿病認知功能障礙中尤為關鍵，抑制海馬區炎癥反應對其治療有益［12］。轉化生長因子-β（TGF-β）家族的生長因子除了對細胞生長具有免疫調節作用，還在炎癥及應激反應中起重要作用［13］。TGF-β 是由細胞分泌的潛在復合物，含有TGF-β 及其前肽LAP（潛在相關肽）。在大多數細胞中，LAP與潛在TGF-β結合蛋白（LTBP）共價連接。LTBPs 是TGF-βs 高效分泌和正確折疊所必需的，LTBPs分泌的大量潛在復合物通過LTBPs的N端與細胞外基質共價結合。LTBPs家族具有典型的重復序列結構域，目前已鑒定出4 種不同的LTBPs和2種纖維蛋白，這其中包括LTBP2。有研究發現，LTBP2 通過與 LTBP1 競爭纖維蛋白-1 的結合位點，間接引起TGF-β 的激活，與多種疾病介導的炎癥、氧化應激密切相關，且可誘導細胞凋亡［8］。沉默LTBP2基因可以通過減輕心肌氧化應激損傷，抑制擴張型心肌病大鼠心肌纖維化與心肌重塑，進而減輕心肌纖維化［7］。本研究發現，糖尿病狀態下，大鼠海馬區LTBP2 蛋白和LTBP2 mRNA 表達明顯增加，并伴隨海馬區細胞凋亡率增高，大鼠學習能力降低，說明LTBP2 可能會引起糖尿病大鼠學習記憶降低。本研究對糖尿病大鼠海馬注射si-LTBP2來沉默LTBP2表達，發現凋亡率明顯降低，大鼠學習記憶能力得到明顯改善，提示LTBP2 介導了糖尿病認知功能障礙，但具體機制不清。

3.3 LTBP2通過TLR4/NF-κB信號通路介導糖尿病大鼠學習記憶功能障礙 TLR4/NF-κB 信號通路與多種炎癥因子的表達調控有關，該通路介導了腦缺血時神經元的損傷［14］。TLR4 可通過選擇性識別內源性損傷相關的分子最終激活NF-κB，導致腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-6、IL-1β 等炎性因子釋放，誘發炎癥［15］。抑制TLR4/NF-κB 途徑可減弱脂多糖誘導的海馬炎癥反應［14］。TLR4/NF-κB信號通路還可參與異丙酚誘導的神經損傷［16］。因此，本研究對糖尿病大鼠海馬注射si-LTBP2來抑制LTBP2 蛋白的表達。Western blot 檢測結果發現，抑制 LTBP2 的表達后，TLR4 和 NF-κB 蛋白表達水平均顯著下調，這提示LTBP2 介導的糖尿病認知功能障礙與TLR4/NF-κB信號通路密切相關。

綜上所述，糖尿病狀態下會引起LTBP2 表達上調和海馬神經元凋亡，最終引起大鼠學習記憶能力下降。沉默LTBP2表達后可改善糖尿病大鼠認知功能障礙，這可能與抑制TLR4/NFκB 信號通路有關。本研究尚存在不足之處，如未對正常大鼠進行海馬LTBP2基因敲除來驗證LTBP2與學習記憶能力的關系；沉默LTBP2 后，雖然取得了一定的治療效果，但與CON 組還有一定的差距；LTBP2 最終是通過影響TGF-β的表達、分泌或活性發揮作用的，但本研究未對大鼠海馬組織中TGF-β 的表達水平或活性進行檢測；腦立體定位注射為混雜因素，而本研究未設置假手術組，對組間比較會有一定影響。