HPLC測定蔬菜農(nóng)藥殘留的不確定度評定

史凌云

（澤州縣綜合檢驗(yàn)檢測中心 山西晉城 048000）

涕滅威和克百威屬于氨基甲酸酯類農(nóng)藥，被廣泛應(yīng)用于蔬菜、水果等農(nóng)作物的病蟲防治。在使用農(nóng)藥提高農(nóng)作物產(chǎn)量，造福人類的同時(shí)，過量的農(nóng)藥殘留帶來的危害也引起了人們的重視[1]。通過高效液相色譜法對蔬菜中的涕滅威、克百威農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測[2-4]，其結(jié)果對照GB 2763—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥殘留最大限量》可判定試樣中農(nóng)藥殘留是否超標(biāo)，以為人們的日常生活提供一定的質(zhì)量保障。本文通過分析檢測過程中的不確定度來源及其對測定結(jié)果的影響，為正確評價(jià)、使用測量結(jié)果和規(guī)范實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理和控制提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

島津LC-20AT高效液相色譜儀（柱后衍生反應(yīng)裝置和熒光檢測器）、氮吹儀、高速勻漿機(jī)、梅特勒PL202-L型天平、氨基固相萃取小柱、10 mL容量瓶（A級）、移液槍（100 μL～1 000 μL）、50 mL量筒（A級）、10 mL刻度移液管（A級）、5 mL刻度移液管（A級）。

1.1.2 試劑

涕滅威和克百威標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心），濃度均為1 000 mg/L；乙腈、甲醇、丙酮、二氯甲烷，均為色譜純；OPA稀釋劑、鄰苯二甲醛、巰基乙醇，均為Pickering生產(chǎn)；0.05 mol/L NaOH溶液。

1.2 色譜條件

色譜柱：C18柱，250 mm×4.6 mm，5 mm。柱溫：50 ℃。熒光檢測器：λex=330 nm，λem=465 nm。柱后衍生：0.05 mol/L NaOH溶液，流速0.5 mL/min；OPA試劑，流速0.5 mL/min。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

依據(jù)NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測定》第3部分，稱取25.0 g 樣品放入勻漿機(jī)中，加入50.0 mL 乙腈，在勻漿機(jī)中高速勻漿2 min 后用濾紙過濾，濾液收集到裝有5 g～7 g 氯化鈉的100 mL 具塞量筒中，收集濾液40 mL～50 mL，蓋上塞子，劇烈振蕩1 min 后，在室溫下靜置30 min，使乙腈相和水相分層。從100 mL 具塞量筒中準(zhǔn)確吸取10.00 mL 乙腈相溶液，放入150 mL 燒杯中，將燒杯放在80 ℃水浴鍋加熱，并向杯內(nèi)緩緩?fù)ㄈ氲獨(dú)猓瑢⒁译嬲舭l(fā)近干；加入2.0 mL 甲醇+二氧甲烷（1+99）溶解殘?jiān)w上鋁箔，待凈化。將氨基柱用4.0 mL 甲醇+二氧甲烷（1+99）預(yù)洗條件化，當(dāng)溶劑液面到達(dá)柱吸附層表面時(shí)，立即加入上述待凈化溶液，用15 mL 離心管收集洗脫液。用2 mL 甲醇十二氧甲燒（1+99）洗燒杯后過柱，并重復(fù)一次，將離心管置于氮吹儀上，水浴溫度50 ℃，氨吹蒸發(fā)至近干，用甲醇準(zhǔn)確定容至2.5 mL。在混合器上混勻后，用0.2 μm 濾膜過濾，待測。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋

用1.0 mL 的移液槍吸取1.0 mL 濃度為1 000 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)母液于10 mL 容量瓶中，配制成100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備液。用1.0 mL 的移液槍吸取1.0 mL 的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備液于10 mL 容量瓶中，配制成10 μg/mL 的標(biāo)液，用于加標(biāo)回收率的測定和工作液的配制。用移液槍吸取100 μL 的標(biāo)液于10 mL 的容量瓶中，配制成0.1 μg/mL 的工作液。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源分析

不確定度來源主要有三類：（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度符號為Urel標(biāo)；（2）樣品前處理，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度符號為Urel前；（3）色譜儀，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度符號為Urel儀。

2.2 不確定度的評定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度

（1）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度

自國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心購買濃度均為1 000 mg/L 的涕滅威和克百威的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其定值的擴(kuò)展不確定度均為2%，k=2，屬于B 類評定，則涕滅威和克百威的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度均為： Urel標(biāo)1=2%/2=0.01。

（2）標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋配制過程

涕滅威和克百威工作液配制過程相同，均用甲醇少量多次沖洗后轉(zhuǎn)移至容量瓶中[5]。

對于移液槍（100 μL～1 000 μL），根據(jù)檢定證書提供的信息，其100 μL 時(shí)的重復(fù)性誤差為1.6%，按均勻分布處理，其1 000 μL 時(shí)的重復(fù)性誤差為0.2%，按均勻分布處理，。

依據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》，單標(biāo)線10 mL 容量瓶（A 級）的容量允差為±0.02 mL，按三角分布處理，。

則涕滅威和克百威標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度均為：

（3）標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

涕滅威和克百威標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度均為：

2.2.2 樣品前處理引入的不確定度

（1）稱量

試樣稱量過程中所用的天平為梅特勒PL202-L 型，其最小分度值為0.01 g。由于天平的精密度不是太高，在稱量過程中數(shù)顯很穩(wěn)定，因此，忽略稱量重復(fù)性引入的不確定度。天平的最大允許誤差為±0.05 g，按均勻分布處理，則由稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（2）提取、凈化、定容

整個(gè)過程中，實(shí)驗(yàn)室溫度在±3 ℃內(nèi)變化，用到試劑為乙腈（體積膨脹系數(shù)為0.001 37/℃）和甲醇（體積膨脹系數(shù)為0.001 10/℃）[6-7]，視溫度變化按均勻分布處理，得到溫度變化下試劑體積膨脹引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表1。

提取、凈化、定容過程中用到的玻璃量具，JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》對其均有相應(yīng)的最大允差。按均三角分布處理，由此得到器具相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表1。

表1 提取、凈化、定容過程中的不確定度

（3）樣品提取、凈化過程（回收率）。

在檢測涕滅威和克百威于試樣中的殘留時(shí)，對于氮吹、萃取等過程中引入的不確定度，可選擇在6 組質(zhì)量為25.0 g 的試樣中添加0.03 mg/kg 涕滅威和克百威的標(biāo)準(zhǔn)溶液，計(jì)算其回收率來評定。標(biāo)準(zhǔn)偏差運(yùn)用極差法計(jì)算，極差系數(shù)為2.53。

涕滅威的回收率為：91.1%、88.9%、86.7%、90.5%、89.2%、87.5%；其中mg/kg，mg/kg，

克百威的回收率為：105.1%、106.4%、103.8%、100.2%、105.4%、106.3%；其中=0.009 6。

（4）樣品前處理引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.2.3 色譜儀檢測過程引入的不確定度

（1）高效液相色譜儀

根據(jù)儀器檢定證書的數(shù)據(jù)，6 次的定量重復(fù)性誤差為1.96%，則色譜儀引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為 urel,LC= 0.008。

（2）峰面積差異

因衍生設(shè)備未強(qiáng)制檢定，則對峰面積差異引入的不確定度評定時(shí)，只考慮試樣的重復(fù)測量來評定。將0.10 mg/L 的涕滅威和克百威的工作液重復(fù)測量6 次，涕滅威峰面積（單位：mV*min）分別為480 669、480 635、480 614、480 625、480 618、480 602，均值為480 627，極差為67；涕滅威峰面積（單位：mV*min）分別為333 548、333 597、333 554、333 588、333 536、333 524；均值為333 554，極差為73。

測量6 次時(shí)的極差系數(shù)為2.53，則涕滅威的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u涕重=67÷2.53=26.48，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為 urel涕重=26.48÷480 627=0.000 055；同理可得克百威的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u克重=73÷2.53=28.85 ，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel克重=28.85÷333 554=0.000 086。

（3）色譜儀檢測過程中的不確定度

色譜儀檢測過程中的不確定度來源有儀器本身引入的不確定度和峰面積差異引入的不確定度，峰面積差異引入的相對不確定度可忽略不計(jì)。

2.3 總相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對擴(kuò)展不確定度

修約后涕滅威和克百威的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度均為0.020，則相對擴(kuò)展不確定度均為Urel=0.040（k=2）。

2.4 測定結(jié)果

經(jīng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到試樣中涕滅威的最佳估計(jì)值為ω涕=0.03 mg/kg，其擴(kuò)展不確定度為U涕=Urel×ω涕=0.040×0.03 mg/kg=0.001 2 mg/kg，故此次測量試樣中涕滅威含量為（0.03±0.001 2）mg/kg，k=2。同理試樣中克百威的最佳估計(jì)值為ω克=0.025 mg/kg，其擴(kuò)展不確定度為U克=Urel×ω克=0.040×0.025 mg/kg=0.001 0 mg/kg，此次測量試樣中克百威含量為（0.025±0.001 0）mg/kg，k=2。

3 結(jié)語

分析檢測涕滅威和克百威在試樣中殘留的各個(gè)步驟，發(fā)現(xiàn)影響整個(gè)過程不確定度的主要因素為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的稀釋過程和前處理過程。因此，實(shí)際中要按照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的貯存要求來保存標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其儲備液；在檢測過程中，檢驗(yàn)人員要規(guī)范器具使用動作，嚴(yán)格控制前處理中提取、凈化、定容步驟中的操作。雖然儀器本身引入的不確定度比較小，但也要做好儀器設(shè)備的檢定、期間核查及日常維護(hù)工作，在測試前做好色譜儀的平衡工作。實(shí)驗(yàn)的每一個(gè)步驟都不可大意，要嚴(yán)格按照作業(yè)指導(dǎo)書規(guī)范自己的操作，以減小測定結(jié)果的不確定度。