周廣文， 陳 麗， 王靜芝， 吳永貴， 梁鳳霞

(湖北中醫藥大學， 武漢 430065)

據世界衛生組織統計，至2016年全球有超過19億人超重，其中6.5億已發展成為肥胖。不僅如此，在這19億人口中有3.4億為青少年[1]，肥胖已成為世界范圍內普遍流行的疾病。過高的體質量指數(body mass index，BMI)是心血管疾病、糖尿病、肌肉骨骼系統疾病及癌癥的主要風險因素。對于肥胖兒童來說，除了承受心理壓力外，還可能出現呼吸困難、骨折、高血壓及胰島素抵抗等病理狀態。因此，及早干預機體超重及肥胖狀態,對提高人們生活質量具有重要意義。

越來越多的證據表明，腸道微生物通過影響腸道屏障功能參與以代謝紊亂為特征的低度炎癥的發病[2]。當腸道上皮屏障功能減弱，腸道微生物及其有害代謝產物可作為抗原進入上皮細胞，促使樹突狀細胞和巨噬細胞在提呈抗原的同時分泌腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和白細胞介素1β(interleukin 1β, IL-1β)等促炎因子，引發全身炎癥反應[3]。最近的調查結果顯示，肥胖及其代謝后果，如高血壓、糖尿病等均與腸道屏障功能的破壞有關。腸屏障功能障礙可導致炎癥加重，而炎癥又可通過破壞緊密連接蛋白而進一步破壞腸道屏障[4]。針灸能夠通過多方面機制改善肥胖及胰島素抵抗，包括調節脂肪代謝，減輕機體炎癥反應及氧化應激，影響食欲調節激素及下游信號通路抑制食欲等[5]。本實驗旨在研究不同部位腧穴配伍電針對胰島素抵抗肥胖大鼠腸道屏障功能及腸道炎癥狀態的影響，為臨床推廣運用“標本配穴” 法治療胰島素抵抗肥胖提供實驗依據。本研究通過湖北中醫藥大學動物倫理委員會審查，批準編號201703001。

1 材料

1.1 動物

SPF級健康雄性Wistar 大鼠60只，7周齡，體質量170～210 g，由湖北省實驗動物研究中心提供，實驗動物合格證號SCXK(鄂)2015-0018。經檢疫觀察后進入湖北中醫藥大學SPF級動物實驗室飼養，室溫20～24 ℃，濕度40%～60%，光照時間12 h/d，動物自由飲水攝食。

1.2 主要試劑及儀器

閉鎖連接蛋白-1 (zonula occludens-1, ZO-1，美國affbiotech，AF5145)；緊密連接蛋白(Occludin，美國Abcam，ab31721)；TNF-α(美國Abcam，ab6671)；IL-1β(北京博奧森,bs-20448 R)；HRP標記的二抗(美國ASPEN,AS1107)；熒光定量PCR試劑盒(日本TaKaRa，RR420A)；反轉錄試劑盒(日本TaKaRa，RR047A)。

0.30 ×15 mm華佗牌毫針(蘇州醫療用品廠有限公司)；HANS LH202 H型電針治療儀(北京華運安特科技有限責任公司)；強生穩豪倍優型快速血糖儀(Surestep美國強生)；ADVIA2400型全自動生化分析儀(德國西門子)；TGL-16c型離心機(上海安亭科學儀器廠)，DYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠)；DR-200Bs型酶標儀(Diatek，中國德朗)；熒光定量PCR儀(美國Life technologies，StepOne? Real-Time PCR System)。

2 方法

2.1 動物分組及造模

所有大鼠適應性喂養1周后分為正常組(A組)8只，給予普通飼料喂養，余下52只大鼠采用高脂飼料(總熱量5.4 kcal/g)喂養8周，建立胰島素抵抗肥胖大鼠模型。將造模后體質量超出普食喂養大鼠20%者作為實驗性肥胖大鼠，并從中隨機選取5只行高胰島素-正葡萄糖鉗夾術[6]，以檢測全身胰島素敏感性，以葡萄糖輸注速率(glucose infusion rate，GIR)判斷是否存在胰島素抵抗。以正常組大鼠的GIR平均值作為標準，若所測大鼠的GIR小于標準值20%則認定為胰島素抵抗。選取造模成功的32只大鼠隨機分為模型組(B組)、腹部電針干預組(C組)、下肢電針干預組(D組)、標本配穴電針干預組(E組)4組各8只。

2.2 干預方法

A組和B組不給予任何處理。C組選取“關元”和“中脘”，D組選取“足三里”和“豐隆”，E組選取“中脘”“關元”“足三里”“豐隆”4穴進行電針治療。用不銹鋼毫針直刺“足三里”“豐隆”穴，深度3～5 mm，每次取單側，左右交替使用；“關元”穴向劍突方向，“中脘”穴向恥骨聯合方向斜刺 3～5 mm。同側“足三里”“豐隆”穴連接電針治療儀的1對電極，“關元”“中脘”連接1對電極，電針參數為2 Hz，1 mA，連續波。每日電針10 min，每周治療 3 次，共治療8周。

2.3 取材與指標檢測方法

2.3.1 體質量、血糖和GIR檢測 體質量、血糖和GIR在電針干預前后分別測量，血糖采用尾部取血，快速血糖儀測定，GIR采用高胰島素-正葡萄糖鉗夾術以檢測全身胰島素敏感性，操作方法如前[6]。其中，體質量、空腹血糖和GIR在大鼠禁食12～14 h后檢測，餐后血糖于大鼠進食后2～4 h檢測。

2.3.2 取材 8周治療結束后，大鼠禁食12～14 h，2%戊巴比妥鈉(0.25 mL/100 g)腹腔麻醉。分離大鼠距肛門6～8 cm處的3 cm結腸組織，于預冷的0.9%氯化鈉溶液中洗凈內容物后吸去水分，置于凍存管中-80 ℃保存待測。

2.3.3 免疫印跡法測定ZO-1、Occludin、TNF-α、IL-1β的蛋白表達 將各組結腸組織用RIPA裂解后提取總蛋白，BCA 法測定濃度后以30～40 μg蛋白加樣，SDS-PAGE分離蛋白，以300 mA恒流轉膜后，用5%脫脂奶粉常溫封閉PVDF膜1 h，加入一抗ZO-1(1∶500)、Occludin(1∶1 500)、TNF-α(1∶1 000)、IL-1β (1∶500)和β-actin (1：10 000)4 ℃孵育過夜，加入二抗(1:10 000)室溫孵育30 min，洗膜后用ECL發光法顯影。以目的條帶和β-actin 條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。

2.3.4 實時熒光定量PCR測定ZO-1、Occludin 、TNF-α、IL-1β的mRNA表達 各組結腸組織充分研磨后加入 Trizol提取總RNA，并檢測其濃度和純度。使用反轉錄試劑盒合成cDNA，使用熒光定量試劑盒進行熒光定量PCR，反應程序為：預變性95 ℃，1 min；循環(40次)95 ℃ 15 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 45 s；熔解曲線60 ℃→95 ℃，每20 s升溫1 ℃。采用2-ΔΔCt法進行數據分析，引物序列見表1。

表1 引物序列表

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 不同腧穴配伍對大鼠體質量、血糖和GIR的影響

圖1示，治療前與A組比較，B、C、D和E組大鼠體質量、餐后血糖明顯升高(P<0.01，P<0.05)，GIR明顯降低(P<0.01)。治療結束后，與A組比較，B組大鼠體質量、空腹血糖、餐后血糖明顯升高(P<0.01)，GIR明顯降低(P<0.01)；與B組比較，C、D與E組大鼠的體質量、餐后血糖明顯降低(P<0.05，P<0.01)，GIR明顯升高(P<0.05，P<0.01)。

注：與A組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與B組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；正常組(A組)；模型組(B組)；腹部電針干預組(C組)；下肢電針干預組(D組)；標本配穴電針干預組(E組)

3.2 不同腧穴配伍對腸道組織ZO-1、Occludin的影響

圖2示，與A組比較，B組ZO-1、Occludin基因與蛋白的表達均明顯降低(P<0.01)；與B組比較，C組和E組ZO-1的蛋白水平明顯升高(P<0.05)，C組、D組和E組Occludin蛋白水平均明顯升高(P<0.01)，E組ZO-1和Occludin的mRNA水平明顯升高(P<0.05，P<0.01)；與E組比較，C組和D組的Occludin蛋白水平較低(P<0.05)。

注：與A組比較：2)P<0.01；與B組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；與E組比較：5)P<0.05；正常組(A組)；模型組(B組)；腹部電針干預組(C組)；下肢電針干預組(D組)；標本配穴電針干預組(E組)

3.3 不同腧穴配伍對腸道炎癥因子TNF-α和IL-1β的影響

圖3示，與A組比較，B組TNF-α、IL-1β蛋白與mRNA的表達均明顯升高(P<0.01，P<0.05)；與B組比較，E組大鼠TNF-α、IL-1β蛋白與mRNA水平均顯著降低(P<0.01)；C組和D組TNF-α、IL-1β蛋白水平明顯降低(P<0.05，P<0.01)；與E組比較，C組和D組的TNF-α、IL-1β蛋白水平升高(P<0.01)。

注：與A組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與B組比較：3)P<0.05；4)P<0.01；與E組比較：6)P<0.01；正常組(A組)；模型組(B組)；腹部電針干預組(C組)；下肢電針干預組(D組)；標本配穴電針干預組(E組)

4 討論

當前肥胖已成為日趨嚴重的社會及健康問題，其不僅是單純的體質量增加，還與代謝綜合征密切相關，包括血脂異常、高胰島素血癥、高血糖、高血壓病等。目前普遍認為肥胖與“脂肪-胰島內分泌軸”抵抗有關。肥胖患者由于對瘦素及胰島素的敏感性降低，使得“脂肪-胰島素軸”反饋作用減弱，從而加重血脂代謝紊亂[7]。其疾病發生和進展都與胰島素抵抗及其信號調控途徑紊亂密切相關。而不少中藥也證實具有改善IR的作用，如一些單味中藥提取物或中藥復方，黃蜀葵花總黃酮、小檗堿、黃芪多糖以及黃芪湯等[8]。目前國內外研究顯示，針刺也是治療單純性肥胖的有效工具[9]。針刺可以通過神經-內分泌途徑調節胰島素信號通路的功能活動，進而調節胰島素的分泌，還可以通過調節胰島素靶器官的糖脂代謝水平與氧化應激反應，提高胰島素抵抗患者胰島素敏感性[10]。而針刺改善胰島素抵抗的作用是否同調節腸道菌群微環境有關的研究較少。目前，腸道菌群已被認為是代謝疾病發展的重要因素，并被作為一種內分泌器官參與機體能量穩態和宿主免疫的調節[11]。腸道屏障是腸道菌群與宿主之間相互作用的重要橋梁，腸黏膜屏障功能發生障礙時，腸內細菌及內毒素易位是導致肥胖和胰島素抵抗的重要因素。研究發現，糖尿病小鼠的雙歧桿菌和乳酸菌減少，腸道黏膜緊密連接蛋白及 ZO-1 表達水平降低，腸道通透性增加，炎癥因子 TNF-α、IL-6 等水平提高；而當研究人員選擇性增加雙歧桿菌、乳酸菌后，緊密連接蛋白水平恢復正常狀態，炎癥因子水平下降，提示腸道屏障損傷在腸道菌群紊亂介導的糖尿病發生中起重要作用[12]。此外，高脂飲食可通過減少緊密連接蛋白 ZO-1和閉合蛋白的編碼基因，表達引起腸道屏障功能減弱，滲透性增加，從而促進脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)吸收入血，產生內毒素血癥[13]。后者還可引起厚壁菌門比例增加，擬桿菌門比例下降，從而加劇腸道菌群失調。LPS 結合蛋白和 CD14+單核細胞與LPS 結合并將其呈遞給 toll樣受體4(toll-like receptor 4,TLR4)/髓樣分化受體2 (myeloid differentiation receptor 2,MD2)受體復合體，誘導宿主產生免疫應答相關蛋白，產生 IL-1β、TNF-α和 IL-6，發生低度炎癥反應，加劇肥胖和胰島素抵抗的進程[14]。這些研究結果表明，腸道屏障功能的破壞及腸道慢性炎癥的發生是腸道微生物群誘發胰島素抵抗發病的關鍵因素。因此，抑制腸道炎癥、減輕腸屏障功能障礙是改善胰島素抵抗肥胖的潛在途徑。

研究表明，不同部位的腧穴針刺對腸道的作用各不相同，如下肢穴位和腹部穴位均廣泛作用于調節胃腸運動障礙[15]。而從部位上劃分，本次研究選取的中脘、關元位于腹部，足三里、豐隆位于下肢部。腹部為脂肪最容易堆積處，同時也是脾經、胃經、腎經、任脈等多經的循行所過之處。刺激腹部可以最大程度上疏通經脈，消濁降脂[16]。根據腧穴的近治作用，在治療時選取腹部穴位治療，體現了“腧穴所在，主治所在”。研究表明，腹部電針對減輕內臟超敏癥狀和保護胃腸道有積極作用[17],而艾灸腹部募穴能夠選擇性調節腸道益生菌群，如溫和灸“關元”穴能夠使雙歧桿菌、乳酸桿菌數量顯著增加，溫和灸“天樞”穴能夠使大腸桿菌、腸球菌數量顯著增加，進而調節腸道菌群失調[18]。而本次研究也證實，腹部電針能夠減輕肥胖大鼠的體質量、降低血糖、提高GIR，并能提高肥胖大鼠腸道Occludin、ZO-1蛋白與mRNA的含量，明顯降低TNF-α、IL-1β蛋白水平。而根據腧穴的遠治作用，治療選取脾胃經經脈所過之處的下肢腧穴為主(特定穴多分布于膝關節以下)，體現“經脈所過，主治所及”[19]。如研究顯示，電針“足三里”可能通過AMP 依賴的蛋白激酶(amp-activated protein kinase,AMPK)/Unc-51樣激酶1(unc-51-like kinase1,ULK1)信號，抑制功能性消化不良大鼠過度自噬而促進胃腸運動[20]。課題組前期與本次研究均表明，電針“足三里”“豐隆”穴能夠降糖，增加胰島素敏感性的作用與抑制炎性因子表達，改善腸黏膜屏障作用有關[6]。前期研究還發現，針刺腹部、下肢部穴位均可改善大鼠的肥胖狀態,其機制可能與調控瘦素(leptin，LEP)、膽囊收縮素(cholecystokinin,CCK)的表達,從而延遲胃排空,加快小腸推進率,減少進食量有關[21]。已有臨床研究表明，在降低單純性肥胖患者體質量及改善血脂方面，基于“標本配穴”理論的針灸療法取得了與西醫減肥藥同等的療效。在改善胰島素抵抗方面，針灸療法顯著勝于西藥療法，且“標本配穴”針灸療法為無不良反應的綠色療法[22]。而本次研究結果也表明，與單純的腹部取穴或下肢取穴組比較，將腹部和下肢部穴位聯用的標本配穴組，能更為顯著地降低肥胖大鼠的體質量，增強腸道Occludin、ZO-1表達，降低腸道內IL-1β和TNF-α的表達。

綜上所述，標本配穴針刺能夠通過下調腸道炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達，抑制炎癥反應，同時增強腸道緊密連接關鍵蛋白Occludin和ZO-1的表達，恢復其腸道屏障功能，從而維持腸道穩態，改善胰島素抵抗肥胖。