煙葉穩定碳同位素組成受控因素分析

毛佳琦，鄭允允，張二強，王 培，付玉潔，王 瑤

（1.浙江大學中原研究院，河南 鄭州 450001；2.陜西中煙工業有限責任公司技術中心，陜西 寶雞 721013）

【研究意義】碳的兩種穩定性同位素12C 和13C 因原子質量不同而使其在分解速率、化學鍵能強度、氣相中傳導速率等物理化學性質上具有差異性，從而導致植物體生物化學反應前后碳同位素組成（δ13C）的改變，即同位素分餾［1］。C3 植物的δ13C 值分布在-22‰～-35‰，該值與植物生理特征、遺傳特性、生長環境、光合作用類型等多種因素密切相關［2］。煙葉屬C3 植物，是一種對生態環境較為敏感的經濟作物，在烤煙種植過程中生態環境的差異會對葉片的光合速率、水分利用效率和氣孔開閉等各種生理狀態產生影響，導致不同生態種植區煙葉δ13C 值存在差異?！厩叭搜芯窟M展】煙葉13C 值受非生物因素如水分、溫度、光強和光質、土壤鹽分、CO2濃度、海拔高度、經度、緯度等和生物因素如煙葉部位、葉片成熟期、葉片結構等多種因素影響，因此，煙葉δ13C 值是煙葉種植產地氣候環境信息和其內部復雜生理生態過程的綜合表征［2-4］。不同生態種植區的煙葉由于氣候環境條件影響，導致不同種植區煙葉δ13C 值存在差異。自20 世紀50 年代發現不同植物間穩定碳同位素組成存在差異以來［5-6］，隨著質譜測定技術發展，穩定碳同位素技術在植物水分利用效率、光合作用途徑、植物群落水平、樹木年輪、土壤-植物碳循環、植物對氣候變化響應和適應、農產品產地溯源等方面得到廣泛應用［7-12］，在生理生態學領域主要用于研究穩定碳同位素組成的小范圍變化與作物品種差異的關系及環境因子對植物穩定碳同位素組成的影響［13-14］。而煙葉穩定碳同位素的研究起步相對較晚且相關報道較少，主要集中在煙葉δ13C 值與其生理品質特征、化學成分的關系等方面［3,15-16］?！颈狙芯壳腥朦c】目前關于煙葉穩定碳同位素組成與葉位和經緯度的關系及不同香型的烤煙碳同位素組成的差異等方面鮮有報道。【擬解決的關鍵問題】本研究通過探索煙葉穩定碳同位素組成與葉位關系并進行橫向、縱向（緯度、經度）對比，探討分析煙葉穩定碳同位素組成的受控因素，以及碳同位素組成對不同香型煙葉的聚類差異，以期為煙草種植評價指標體系的完善及生態適應性機理研究提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

按《中國煙草種植區劃》［17］中劃分的一級煙草種植區選取其中4 個種植區為研究區域，分別為西南煙草種植區（云南、貴州等地）、東南煙草種植區（江西、福建等地）、長江中上游煙草種植區（重慶、湖北、湖南等地）和黃淮煙草種植區（陜西、河南等地）。按照煙葉著生部位不同分別隨機選取384 株不同產地的煙田中達到生理成熟期的煙草植株的上部煙葉（自下而上第3～5 葉位葉片）、中部煙葉（自下而上第9～11 葉位葉片）和下部煙葉（自下而上第15～17 葉位葉片）為試驗材料，樣品涉及14 個二級劃分區9 個省24 個地市，具有分布范圍廣、類型全、數量多等特點，具有一定的代表性。采集后的樣品用蒸餾水洗凈后截取每片葉片的中心部位（同一片葉子的中間部位是氣孔密度和氣孔指數最穩定的區域［18］）于70℃烘干，粉碎后過178 μm 篩備檢。

1.2 試驗方法

穩定碳同位素組成測定：處理后的樣品在高純氧氣條件下經高溫充分燃燒后生成CO2，提取燃燒產物CO2，采用Flash2000-MAT253 同位素分析儀（美國ThermoFisher 公司）測定穩定碳同位素比率，分析結果參照國際標準（Pee Dee Belnite或PDB），根據如下公式計算：

式中，δ13C 表示煙葉穩定碳同位素組成；(13C/12C)PDB表示南卡羅來納州白碚石中的13C/12C。

檢測條件：標準樣品IAEA-600（caffeine，δ13CV-PDB=-27.771‰±0.043‰，δ15Nair=-1.0‰±0.2‰），氧化溫度960 ℃，載氣流速100 mL/min，氧氣流速280 mL/min。

試驗數據采用IBM SPSS 20.0 進行統計分析，圖表采用OriginPro8.5 繪制。

2 結果與分析

2.1 煙葉穩定碳同位素組成隨經緯度分布情況

基于全球尺度對植物的生長研究發現，隨著經緯度變化，在各種環境因子如溫度、降水的影響下，植物形成了對環境變化的不同響應，δ13C 值與經緯度具有一定相關性［19-20］。本研究所選取的樣本種植區覆蓋99°17′E～118°26′E、23°88′N～35°53′N，東西跨越19 個經度，南北跨越12 個緯度，樣本δ13C 值分布范圍為-27.76‰～-25.39‰，平均值為-26.46‰。

2.1.1 煙葉δ13C 值隨經度的變化 如圖1 所示，在99°17′E～118°26′E 范圍內，煙葉δ13C 值呈現隨經度增加而逐漸減小的趨勢，δ13C 值與經度之間呈極顯著負相關性，從地理位置上自西向東，經度每增加1°，煙葉δ13C 值減小0.09‰。經度變化本身并不會對植物δ13C 值產生影響，而是由于隨著地理位置變化而改變的環境因子（如溫度、降水等）造成植物δ13C 值空間分布的差異性［20-21］。

圖1 煙葉δ13C 值隨經度的分布Fig.1 Distribution of δ13C values of tobacco leaves with longitude

我國氣溫和降水量分別呈現自西向東逐漸降低和梯度增加的特點，在99°17′E～118°26′E范圍內，氣候呈現東面濕潤、西面較干燥的特點，東部地區陰雨天時間較多，而西部地區天晴少雨的時間更長。當降水量減少時，水分脅迫加劇，土壤及空氣含水量降低，植物往往通過關閉部分氣孔來降低氣孔傳導速率，葉內CO2濃度降低，對13C 的辨別力降低，葉片光合作用所固定的δ13C值增加［1］。而溫度升高同樣也會導致土壤水分蒸發加快從而降低土壤水分可利用量，使δ13C 值偏正。而個別經度范圍如109°41′E～109°76′E，煙葉δ13C 值呈現略增大趨勢，這可能是該地域范圍內其他環境因素協同作用的結果。

2.1.2 煙葉δ13C 值隨緯度的變化 試驗結果顯示，在23°88′N～35°53′N 地區范圍之內，煙葉δ13C 值與緯度之間無顯著線性相關性（圖2A），與一些C3 植物如艾蒿、藜、平車前等的δ13C 值與緯度呈顯著負相關性的研究結果有所不同［14］。進一步分析發現，在23°88′N～27°50′N 范圍內，由南向北，煙葉δ13C 值由重逐漸變輕；在27°50′N～35°53′N 范圍內，煙葉δ13C 值由南向北則呈現由輕逐漸變重的特征，整體呈現以N27°50′為谷底的“V”字型變化特征，采用二次曲線對結果進行擬合（圖2B）后發現δ13C 值與緯度平方的回歸方程達到顯著水平，總體而言，煙葉δ13C 值表現出隨緯度增加先降后升的趨勢。

圖2 煙葉δ13C 值隨緯度的分布Fig.2 Distribution of δ13C values of tobacco leaves with latitude

2.2 不同葉位穩定碳同位素組成差異

圖3 為4 個一級種植區不同葉位煙葉穩定碳同位素組成分布。長江中上游種植區煙葉δ13C 值在-28.05‰～-25.28‰之間，均值為-26.74‰；黃淮種植區煙葉δ13C 值在-27.95‰～-24.70‰之間，均值為-25.94‰；東南種植區煙葉δ13C 值在-28.79‰～-25.65‰，均值為-27.19‰；西南種植區煙葉δ13C 值在-27.50‰～24.90‰之間，均值為-25.93‰；西南種植區和黃淮種植區不同葉位的煙葉δ13C 值均顯著高于其余兩地煙葉對應葉位的δ13C 值，而西南和黃淮兩個種植區相同葉位的δ13C 值無顯著性差異。東南種植區上部、中部和下部葉片的δ13C 值在4 個種植區中均為最小值。4個種植區的煙葉δ13C值均隨葉位的升高而增大，下部葉片的δ13C 值較小，且同一地區不同葉位的δ13C 值有顯著性差異。這可能是由于土壤呼吸所釋放的CO2的δ13C 的平均值為-12‰～-25‰，而大氣中CO2的δ13C 平均值為-7.8‰，兩者之間存在較大差異，而靠近土壤的葉片較多的吸收更負的δ13C 值的CO2源，其δ13C 值減小，因此即使生長在同一地區同一環境的煙葉，因CO2來源不同，不同葉位的煙葉內部碳同位素組成也不同［22-23］。δ13C 值同時也表征了植物葉片在光合作用活躍期的平均光照狀況，該值偏低，說明葉片在生長期接收光照較少，由此可以推斷煙葉上部葉片獲得的光照多于下部葉片，因而其葉片碳同位素組成高于下部葉片［4,24］。

圖3 4 個一級種植區煙葉δ13C 值隨葉位的分布Fig.3 Distribution of δ13C values of tobacco leaves with leaf position in four first class planting areas

2.3 穩定碳同位素對煙葉的聚類分析

我國烤煙類型按照煙葉香型可以分為清甜香型、蜜甜香型、醇甜香型、焦甜焦香型、焦甜醇甜香型、清甜蜜甜香型、蜜甜焦香型、木香蜜甜香型等八大香型［25］。通過對不同產地不同香型煙葉的δ13C 值進行聚類分析（圖4）發現，當聚類距離＜5 時，樣本可以被分為三類：第一類為高δ13C 值，清香甜香型烤煙：臨滄烤煙、曲靖烤煙、玉溪烤煙、大理烤煙、昆明烤煙、保山烤煙、楚雄烤煙；第二類為較高δ13C 值，焦甜焦香型、清甜蜜甜香型和焦甜醇甜香型：渭南烤煙、銅川烤煙、南平烤煙、三明烤煙、龍巖烤煙和撫州烤煙；第三類為較低δ13C 值，焦甜醇甜香型、醇甜香型和蜜甜香型：韶關烤煙、郴州烤煙、湘西烤煙、安康烤煙、商洛烤煙、漢中烤煙、貴陽烤煙、遵義烤煙。當聚類距離＜2 時，醇甜香型烤煙可單獨被分為一類為低δ13C 值：湘西烤煙、安康烤煙、商洛烤煙和漢中烤煙。

圖4 基于不同產地煙葉的δ13C 值聚類結果Fig.4 Cluster results of tobacco leaves from different areas based on δ13C values

3 討論

植物碳同位素組成受多種生物因素和非生物因素的影響［2］，雖然植物組織內的δ13C 值最終由生物因素決定，但生物因素受其生長地區環境因子的影響，因而植物的碳同位素組成蘊含其生理生態特征和環境信息［4］。煙草是一種適應性廣且對生態環境條件十分敏感的經濟作物，生態環境影響煙葉的品質和香型，煙草品質差異，“良由地氣使然也”［26-27］。本研究發現，在99°17′E～118°26′E 范圍內，煙葉δ13C 值與經度呈顯著負相關關系，經度每增加1°，煙葉δ13C值減小0.09‰，這與李嘉竹［14］對陸地C3、C4 草本植物的研究結果一致；在23°88′N～35°53′N地區范圍內，煙葉δ13C 值與緯度之間呈一種非線性關系，通過二次曲線進行擬合發現具有二次拋物線特征，即從整體來看煙葉δ13C 值表現出隨緯度增加先下降后上升趨勢。這與李嘉竹［14］研究的植物葉片碳同位素與緯度也呈負相關關系的結果不太相同，可能是由于煙葉δ13C 值受局部地區環境條件的影響。然而經度和緯度并非是導致煙葉δ13C 差異的根本原因，環境因素如光照、降水、溫度、二氧化碳濃度等才是主要原因，不同經、緯度地區的氣候條件和地理環境的差異導致煙葉碳穩定同位素組成差異。通過對同一區域內不同葉位煙葉δ13C 值研究發現，4 個種植區不同葉位煙葉δ13C 值具有顯著差異，隨葉位升高而增大，表現為上部葉片＞中部葉片＞下部葉片，且同一地區不同葉位的δ13C 值有顯著性差異。這與王毅等［16］結論一致。西南種植區和黃淮種植區煙葉碳同位素組成較接近，顯著高于其他兩個種植區，而長江中上游種植區和東南種植區的煙葉碳同位素組成較類似。最后，本研究以δ13C 值為變量，對不同產地不同香型烤煙進行聚類分析發現，可以對清香甜香型和醇甜香型烤煙進行有效聚類，而對焦甜焦香型、清甜蜜甜香型、焦甜醇甜香型和蜜甜香型4 種香型烤煙則沒有明顯的聚類效果，需要加入其他變量如氮同位素等進行進一步研究。本研究初步探明煙葉碳同位素組成與經緯度、葉片以及烤煙香型的關系，但煙葉δ13C 值與烤煙品質、香氣成分之間關系及對其生理指標的關系還有待進一步深入研究。

4 結論

本研究分析了煙葉碳同位素組成與地理空間要素之間的關系，并利用碳同位素對不同香型進行煙葉聚類分析，煙葉穩定碳同位素組成與經度呈負相關關系，經度每增加1°，煙葉δ13C 值減小0.09‰；與緯度整體呈以北緯27°50′為谷底的“V”字型變化特征，擬合后呈二次拋物線關系，不同葉位煙葉穩定碳同位素組成不同，利用δ13C 值可以對清香甜香型和醇甜香型烤煙進行有效聚類。