海洋源芽孢桿菌的分離鑒定及其消化酶代謝產(chǎn)物的測定

伍楚妍，黃曉冰，劉少君，李 洋，謝為天，徐春厚

（廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 湛江 524088）

【研究意義】隨著2020 年養(yǎng)殖業(yè)全面禁用抗生素，尋找安全可靠且高效的抗生素替代產(chǎn)品刻不容緩。海洋低溫、高壓、缺氧、寡營養(yǎng)、高鹽等極端自然條件，致使生活其中的微生物產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎多樣、活性獨(dú)特的天然代謝產(chǎn)物［1］。因陸生生物資源日益匱乏，人們逐漸把開發(fā)天然活性物質(zhì)的研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到海洋。

微生態(tài)制劑能調(diào)節(jié)畜禽腸道菌群、拮抗致病菌、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、降低疾病發(fā)生率［2］，是一種抗生素的理想替代品。在用于制作微生態(tài)制劑的菌源庫中，芽孢桿菌具有獨(dú)特優(yōu)勢。芽孢桿菌能形成芽孢，對周圍的環(huán)境條件如熱量、胃酸和濕度具有很高的穩(wěn)定性［3］。在生長過程中，芽孢桿菌能產(chǎn)生許多具有抗菌活性的代謝物質(zhì)，如多粘菌素、表面活性素、雙效菌素等［4］，且這些抗菌物質(zhì)具有抗菌譜廣、對酸堿度要求不高、熱穩(wěn)定性好等特點(diǎn)［5-6］。此外，芽孢桿菌可產(chǎn)具有很強(qiáng)蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性的代謝產(chǎn)物［7］，用于飼料添加劑可提高飼料轉(zhuǎn)化率，并有效改善養(yǎng)殖動(dòng)物的腸道生態(tài)［8］。因此，在海洋不同環(huán)境條件下生存的芽孢桿菌可能會(huì)在調(diào)節(jié)機(jī)體腸道微生態(tài)平衡方面迸發(fā)出更大潛力。

【前人研究進(jìn)展】目前國內(nèi)對海洋源芽胞桿菌的研究主要圍繞其對重金屬的吸附作用［9］、抗腫瘤物質(zhì)研發(fā)和產(chǎn)蛋白酶發(fā)酵條件優(yōu)化等［10-11］，以及應(yīng)用于微生物菌劑和殺菌劑研發(fā)、紅樹林生態(tài)系統(tǒng)保護(hù)和修復(fù)及防治蔬果病害等方面［12-13］，這些研究都具有較大的市場價(jià)值與社會(huì)價(jià)值。國外對海洋源芽孢桿菌的研究主要圍繞海洋芽孢桿菌Sh10 菌株所產(chǎn)細(xì)菌素對奇異變形桿菌的抗生物膜活性，首次報(bào)道可產(chǎn)生納米維生素的海洋芽孢桿菌及研究其不同環(huán)境下納米維生素的產(chǎn)量、可用性等，可應(yīng)用于醫(yī)療與工業(yè)方面［14-15］。【本研究切入點(diǎn)】近10 年來，國內(nèi)外較少有關(guān)具有潛在應(yīng)用特色的海洋源芽孢桿菌的報(bào)道。本研究從臨近南海、擁有火山錐和豐富紅樹林資源的雷州半島近岸海域的海洋生物及環(huán)境中采集樣品，以期獲得性能優(yōu)良的芽孢桿菌益生菌株，為海洋源芽孢桿菌的菌源庫擴(kuò)充容量，為今后制備微生態(tài)制劑提供優(yōu)質(zhì)菌源。【擬解決的關(guān)鍵問題】對8株優(yōu)質(zhì)海洋益生菌株通過菌株分離、生化試驗(yàn)，形態(tài)、結(jié)構(gòu)、染色、培養(yǎng)特征的觀察及16SrRNA基因測序進(jìn)行分離鑒定，并進(jìn)行消化酶活性物質(zhì)測定。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試樣品采于2020 年下半年，在雷州半島近岸海域采集紅樹根、葉、莖和土壤及中國對蝦、蝦姑、蟹、魚、蠔和螺等，共計(jì)22 份樣品。將魚鰓和內(nèi)臟、螺、蟹內(nèi)臟、蝦和蝦姑消化道以及紅樹根、莖、葉剪碎，分別加入等量生理鹽水；取紅樹林土壤，加入生理鹽水；將樣品生理鹽水混合液充分震蕩，1 000 r/min 離心5 min，取上清液，即為待檢樣品液。

改良的營養(yǎng)肉湯和營養(yǎng)瓊脂：1%大豆蛋白胨、0.5% 牛肉浸膏、2%NaCl、0.1%K2HPO4；121℃滅菌30 min。

27 種細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，購于杭州微生物試劑有限公司。

1.2 芽孢桿菌的分離鑒定

1.2.1 菌株分離 將待測樣品液按2%接種于改良的營養(yǎng)肉湯試管中，置于80 ℃水浴鍋中30 min，取出后迅速冷卻，于35 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h；將該培養(yǎng)物劃線接種于改良的營養(yǎng)瓊脂平板，35 ℃培養(yǎng)24～48 h，根據(jù)菌落的形狀、大小、光澤、邊緣、顏色特征，選取不同的菌落進(jìn)行涂片、染色和鏡檢；將分離菌株接種于改良的營養(yǎng)瓊脂斜面，純培養(yǎng)后保存于4 ℃冰箱中。

1.2.2 菌株形態(tài)、結(jié)構(gòu)、染色和培養(yǎng)特征觀察用顯微鏡觀察革蘭氏染色后分離菌株的菌體形態(tài)、排列方式、有無芽孢及革蘭染色特征；肉眼觀察其在改良的營養(yǎng)瓊脂平板上的菌落特征。

1.2.3 菌株的生化試驗(yàn) 將分離菌株接種于細(xì)菌微量生化反應(yīng)管中，35 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察結(jié)果；根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》［16］對分離菌株進(jìn)行生化試驗(yàn)鑒定。

1.2.4 菌株的16S rRNA 基因測序 PCR 反應(yīng)體 系（30 μL）：上游引物5'-AGAGTTTGAT CMTGGCTCAG-3'（27F）和下游引物5'-GGTTA CCTTGTTACGACTT-3'（1492R）（10 μmol/μL，各0.75 μL），ddH2O（12.9 μL），2×MightAmp Buffer（15 μL），MightyAmp DNA Polymerase（0.6 μL）；用無菌牙簽挑取少量分離菌株的菌落，加入體系中混勻作為DNA 模板。PCR 擴(kuò)增程序：98 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s、57 ℃ 15 s、68 ℃ 90 s，共40 個(gè)循環(huán)；最后在10 ℃下保存10 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將預(yù)期產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結(jié)果在NCBI 和EZBioCloud 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性分析，利用MEGA 6.0 軟件進(jìn)行多序列比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 菌株消化酶代謝產(chǎn)物測定

1.3.1 代謝產(chǎn)物提取 將分離菌株接種于改良的營養(yǎng)肉湯，35 ℃培養(yǎng)24 h，得到第1 代培養(yǎng)物；將其按5%再次接種于改良的營養(yǎng)肉湯，35 ℃、220 r/min 震蕩培養(yǎng)48 h，得到第2 代培養(yǎng)物；將第2 代培養(yǎng)物以4 000 r/min 離心30 min，取上清液用0.22 μm 的微孔濾膜過濾，濾液即為待測的代謝產(chǎn)物。

1.3.2 消化酶活性測定 用福林-酚比色法［17］、淀粉-碘比色法［16］和橄欖油乳化法［18］分別測定代謝產(chǎn)物中的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性。3種酶活力單位定義分別為：100 mL消化酶在37 ℃、30 min 內(nèi)水解10 mg 淀粉為1 個(gè)淀粉酶活力單位；每毫升消化酶在37 ℃下每分鐘水解酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1 個(gè)蛋白酶活力單位；每毫升消化酶在一定條件下水解脂肪每分鐘產(chǎn)生1 μg 分子脂肪酸為1 個(gè)脂肪酶活力單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌的分離鑒定

2.1.1 芽孢桿菌的分離 22 份樣品經(jīng)高溫處理、富集培養(yǎng)和分離培養(yǎng)，共獲得43 株分離菌（表1），經(jīng)形態(tài)、結(jié)構(gòu)和染色特征觀察，均為疑似芽孢桿菌。

表1 43 株分離菌來源Table 1 Sources of 43 isolated strains

2.1.2 菌株的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、染色及培養(yǎng)特征 43株分離菌均為革蘭氏陽性桿菌，以單個(gè)、雙鏈與多鏈的排列方式存在，均形成芽孢，芽孢多位于菌體中央，小于菌體（圖1）。改良的營養(yǎng)瓊脂平板上的菌落均呈灰白色，表面輕度隆起、有皺褶，邊緣不規(guī)則（圖2）。

圖1 分離菌株的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和染色特征（1 000×）Fig.1 Morphology,structure and staining characteristics of isolated strains（1 000×）

圖2 分離菌株的菌落特征Fig.2 Colony characteristics of isolated strains

2.1.3 菌株的生化試驗(yàn)結(jié)果 選取3 種消化酶綜合活性最強(qiáng)的8 株分離菌進(jìn)行生化試驗(yàn)，由表2可知，8 株分離菌均可利用七葉甘、果糖和蔗糖，對甘露糖、纖維二糖、麥芽糖、蕈糖和葡萄糖的發(fā)酵試驗(yàn)及尿素酶產(chǎn)生試驗(yàn)結(jié)果不一，其他糖類發(fā)酵試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)和枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)結(jié)果均為陰性。

表2 8 株分離菌的生化試驗(yàn)Table 2 Biochemical test of 8 isolated strains

2.1.4 菌株的16S rRNA 基因測序結(jié)果 選取3 種消化酶綜合活性最強(qiáng)的8 株分離菌進(jìn)行16S rRNA 基因測序，通過PCR 擴(kuò)增得到8 株疑似芽孢桿菌的16S rRNA 序列，由凝膠電泳分析結(jié)果（圖3）可見，目的條帶基因片段長度約為1 500 bp。在NCBI 和EZBioCloud 網(wǎng)站上進(jìn)行同源性比對，發(fā)現(xiàn)8 株分離菌歸屬為芽孢桿菌屬的4個(gè) 種（表3）。菌 株BC2、BC3、BC6、BC7 和BC8 與其最相似模式菌株的相似性均達(dá)99%以上。結(jié)合其形態(tài)染色特征和生化試驗(yàn)結(jié)果，鑒定為蠟樣芽孢桿菌3 株、暹羅芽孢桿菌1 株和特基拉芽孢桿菌1 株，分別命名為蠟樣芽孢桿菌BC3（Bacillus cereusBC3）、蠟樣芽孢桿菌BC8（Bacillus cereusBC8）、蠟樣芽孢桿菌BC2（Bacillus cereusBC2）、暹羅芽孢桿菌BC6（Bacillus siamensisBC6）和特基拉芽孢桿菌BC7（Bacillus tequilensisBC7）。菌株BC1 與解木糖賴氨酸芽孢桿菌模式菌株相似性為98.35%，疑似為解木糖賴氨酸芽孢桿菌，命名為解木糖賴氨酸芽孢桿菌BC1（Lysinibacillus xylanilyticusBC1）；菌株BC4 和BC5 與暹羅芽孢桿菌模式菌株相似性分別為98.49%和98.54%，疑似為暹羅芽孢桿菌，命名為暹羅芽孢桿菌BC4（Bacillus siamensisBC4）和暹羅芽孢桿菌BC5（Bacillus siamensisBC5）

表3 8 株分離菌與其模式菌株的16S rRNA 序列的相似性Table 3 Similarity of 16S rRNA sequences between 8 isolated strains and their type strains

圖3 8 株分離菌的16S rRNA 基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplification results of 16S rRNA genes of 8 isolated strains

由本研究所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）可知，8 株分離菌可分為4 支，其中菌株BC4、BC5 和BC6 與暹羅芽孢桿菌模式菌株在同一進(jìn)化水平上；菌株BC7 與特基拉芽孢桿菌模式菌株在同一進(jìn)化水平上；菌株BC2、BC3 和BC8 與蠟樣芽孢桿菌模式菌株在同一進(jìn)化水平上；菌株BC1 與解木糖賴氨酸芽孢桿菌模式菌株在同一進(jìn)化水平上。

圖4 基于8 株分離菌16S rRNA 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed based on the 16S rRNA sequences of 8 isolated strains

2.2 消化酶活性測定

由表4 可知，在43 株分離菌中篩選得到蛋白酶、淀粉酶與脂肪酶3 種消化酶綜合活性最強(qiáng)的8 株菌（BC1、BC2、BC3、BC4、BC5、BC6、BC7 和BC8）。8 株芽孢桿菌均產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶代謝產(chǎn)物，以脂肪酶的活性最強(qiáng)；3 種消化酶中，蠟樣芽孢桿菌BC3 產(chǎn)生蛋白酶活性最高，為4.78 U/mL；暹羅芽孢桿菌BC6 產(chǎn)生的淀粉酶活性最高，為2.35 U/mL；解木糖賴氨酸芽孢桿菌BC1 產(chǎn)生的脂肪酶活性最高，為52.13 U/mL。

表4 43 株分離菌株的3 種消化酶活力（U/mL）測定Table 4 Activity determination of three digestive enzymes of 43 isolated strains（U/mL）

3 討論

海洋擁有復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)與生存環(huán)境，與陸地環(huán)境有較大差異，可能會(huì)進(jìn)化出具有優(yōu)良代謝產(chǎn)物的微生物。本研究從臨近南海、擁有火山錐和豐富紅樹林資源的雷州半島近岸海域采集樣品，并分離鑒定出產(chǎn)消化酶活性代謝產(chǎn)物的芽孢桿菌，具備一定的理論與應(yīng)用創(chuàng)新。在所分離鑒定的產(chǎn)消化酶（蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶）的8株芽孢桿菌中，來源于紅樹林的菌株較多。已有研究在紅樹林中分離出纖維素酶較高產(chǎn)的芽孢桿菌［19］，表明紅樹林獨(dú)特的生存環(huán)境與復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)可能會(huì)賦予微生物良好的生存條件。

芽孢桿菌可產(chǎn)生含有蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等多種酶活性的代謝產(chǎn)物，也可在機(jī)體新陳代謝的過程中合成未知因子來增強(qiáng)消化酶活性，可有效促進(jìn)營養(yǎng)成分的吸收，現(xiàn)已作為益生菌應(yīng)用于家禽微生態(tài)制劑［20］。在消化酶活性結(jié)果中，菌株BC1、BC3 和BC7 的綜合酶活性最高。BC7為特基拉芽孢桿菌，該菌所產(chǎn)脂肪酶活性相對較高。相關(guān)研究報(bào)道，在嗜極端細(xì)菌中分離鑒定出產(chǎn)脂肪酶的特基拉芽孢桿菌，其所產(chǎn)脂肪酶的分子水平在各領(lǐng)域應(yīng)用中具有很大潛能［21］。菌株BC3 和BC8 屬蠟樣芽孢桿菌，其產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶活性較強(qiáng)，孫娜等［22］也從海水魚腸道中分離出產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶的蠟樣芽孢桿菌，在海水魚的養(yǎng)殖中極具潛力。已有研究在雞的日糧中添加蠟樣芽孢桿菌制劑，能夠增加肉雞重量、腸道消化酶活性及免疫機(jī)能［23］。菌株BC6 和BC5 為暹羅芽孢桿菌，該種芽孢桿菌含有相對較高的蛋白酶和淀粉酶活性，已有報(bào)道暹羅芽孢桿菌作為飼料添加劑或發(fā)酵劑應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖中以提高生產(chǎn)性能［24］。目前有關(guān)解木糖賴氨酸芽孢桿菌產(chǎn)生消化酶活性方面的研究未見報(bào)道。

本研究分離的芽孢桿菌所產(chǎn)脂肪酶活力最高為52.13 U/mL，蛋白酶活力最高為4.78 U/mL，淀粉酶活力最高為2.35 U/mL。蔣磊等［25］在肉雞日糧中添加市售凝結(jié)芽孢桿菌制劑，測定十二指腸中脂肪酶、胰蛋白酶和淀粉酶活力分別為80.80（±6.62）、225.43（±31.22）、21.54（±1.46）U/mL，表明本研究所測消化酶活性與市售芽孢桿菌仍有較大差異，但不排除有部分消化酶活性受芽孢桿菌在機(jī)體內(nèi)的增強(qiáng)作用。閆一博等［26］在研究實(shí)驗(yàn)室保存菌種枯草芽孢桿菌 KG109 時(shí)，飼喂最低劑量組肉雞的十二指腸脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶活力分別為1.89（±0.06）、20.55（±0.61）、194.91（±3.83）U/mL，本研究所測的脂肪酶活性相對較高。本研究后續(xù)將對8 株芽孢桿菌的藥物敏感性、致病性及毒性等進(jìn)行測定，以期為應(yīng)用于微生態(tài)制劑奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究成功從雷州半島近岸海域采集的22個(gè)樣品中分離出疑似芽孢桿菌43 株，其所產(chǎn)的代謝產(chǎn)物均有消化酶（蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶）活性，但水平參差不齊，其中篩選3 種消化酶綜合活性最高的8 株分離菌鑒定出種名，分別為3株蠟樣芽孢桿菌、3 株暹羅芽孢桿菌、1 株特基拉芽孢桿菌及1 株解木糖賴氨酸芽孢桿菌，這些桿菌的代謝產(chǎn)物脂肪酶活性較高，蛋白酶和淀粉酶活性較低，為海洋源芽孢桿菌微生態(tài)制劑的相關(guān)應(yīng)用提供菌種資源積累。