香稻Badh2 基因單倍型及香氣成分2-乙酰-1-吡咯啉代謝通路的研究進展

潘陽陽，黃道強，王重榮，李 宏，周德貴，王志東，陳宜波，趙 雷，龔 蓉，周少川

（廣東省農業科學院水稻研究所/廣東省水稻育種新技術重點實驗室，廣東 廣州 510640）

香米在蒸煮過程中會散發出令人愉悅的獨特香味，被譽為水稻中的珍品，具有較高的經濟價值。而稻米香味是國際市場上決定香米價格的重要因素之一［1］，優質香米價格是非香稻的3 倍之多［2］。傳統香稻品種具有很強的地域特性，泰國的茉莉香米、印度與巴基斯坦的巴斯馬蒂香米長期占據國際香米市場主要份額，近年來越南、柬埔寨等國的優質香米出口量也在不斷加大。我國作為全球最大的稻米生產國和消費國［3］，市場供需不平衡，每年需進口一定數量的優質香米以滿足國內高端市場需求。因此，加強香稻品種選育，打造我國香米品牌以取代泰國香米，對于提升我國香米國際影響力具有重要的經濟和社會效益。

我國具有豐富的香稻資源，香稻種植歷史可以上溯到3 000 多年前。由于香稻多為地方性品種，兼受產量、抗性和改良技術等條件限制，導致我國香稻生產長期不被重視［4-5］。當前，我國稻米消費市場面臨轉型升級，優質且具有香味的大米深受市場青睞，水稻育種由注重產量向產量品質并重的方向轉型。2018—2020 年，全國農業技術推廣服務中心連續3 年舉辦全國優質稻品種食味品質鑒評會，有力推動我國水稻育種向優質稻育種方向轉型。

香味物質的挖掘和香味基因的遺傳調控是香稻育種的兩個根本問題，長期以來備受關注。前人在稻米中發現了上百種揮發性香味化合物［6-9］，隨著檢測技術水平的提高和研究的不斷深入，1983 年2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline，2AP）被確認為稻米特征香氣成分［10］。水稻香味基因的遺傳研究起始于20 世紀70 年代，早期研究推斷香味基因可能由單個［11］、2 個［12］或3 個［13］隱性基因控制。隨著分子標記技術和水稻功能基因組學的發展，Ahn 等［14］利用分子標記技術將香味基因定位在第8 號染色體上，Bradbury 等［15］圖位克隆到香味主效基因Badh2（LOC_Os08g32870），該基因第7 外顯子8 bp 的缺失和3 個堿基的突變致使基因功能失活，最終引起2AP 積累。

隨著基因組測序技術快速發展，研究者們在香稻資源中挖掘出了更多功能性突變的Badh2單倍型［16-17］，這為香稻育種提供了豐富的香稻基因資源；同時，對香味基因的生化基礎和2AP 生物合成途徑開展了細致研究［18-19］，初步揭示了2AP 的生物合成通路［20］。但香味遺傳性狀十分復雜，不同品種稻米的2AP 含量存在明顯差異、相同品種在不同種植條件下的2AP 含量也不相同［2,21-23］，而如何特異提高精米2AP 含量也是香米產業發展面臨的關鍵問題［1］，這些問題的解決需要進一步解析2AP 生物合成機制，尤其要深入認識籽粒發育過程中2AP 積累機制。本文對已發現的香稻Badh2基因單倍型及不同單倍型香稻中2AP 含量等的研究進行綜述，重點闡述2AP 生物合成通路的研究進展，提出從籽粒發育動態角度研究2AP 積累機制，為香稻資源相關基因利用、籽粒特異富集2AP 的香稻品種研發提供依據。

1 香稻Badh2 基因的單倍型

1.1 香味基因Badh2 的功能研究及利用

水稻Badh2基因編碼甜菜堿醛脫氫酶，該蛋白能夠催化甜菜堿醛合成甜菜堿，從而在抗鹽害、冷害和熱害等逆境脅迫中發揮重要作用［15,24］。研究發現，水稻中存在1 個BADH2 同源蛋白BADH1，且兩個蛋白功能可能發生了明顯分化：Fitzgerald 等［25］發現非香稻中這兩個蛋白均發揮功能，香稻和非香稻品種中BADH1 的轉錄本并不存在差異，BADH1 在響應鹽脅迫中發揮主要作用；He 等［26］發現BADH1 與苗期水稻耐鹽性顯著相關，而BADH2 只與稻米香味性狀密切關聯；BADH2 在pH 10 的堿性條件下具有最大催化活性，催化底物主要為4-氨基丁醛，而BADH1 在pH 9.5 條件下具有催化活性，且對4-氨基丁醛催化活性極低［18］。

表達模式分析表明，Badh2在水稻的地上部分均能表達，亞細胞定位發現BADH2 蛋白主要定位于細胞質［19］。Baicharoen 等［27］深入解析了BADH2 蛋白的3D 結構，發現該蛋白包含NAD+結合域、底物結合域和寡聚化結合域，揭示了關鍵氨基酸殘基如N162、C294、E260 在催化反應中的關鍵作用，為優質香稻改良提供了理論基礎。

隨著分子標記輔助育種、基因編輯育種等技術的發展，通過RNAi、TALEN 等生物技術對Badh2進行敲減或敲除，已成功獲得轉基因香稻材料［28-30］，隨著CRISPR/Cas9 基因編輯系統在作物育種中的廣泛應用，該技術已成為快速獲得香稻材料的重要方法［31-32］。

1.2 香稻資源中Badh2 單倍型的挖掘

基于轉基因存在的潛在風險挑戰，挖掘更多自然變異的香味基因單倍型對于豐富優質香稻育種多樣性具有重要意義。通過對香稻資源的序列分析，目前在Badh2基因編碼區共發現15 種功能性突變的單倍型（表1），這些變化的核苷酸位點分布在第1、2、4、7、8、10、12、13、14外顯子，以小片段序列插入或刪除（Indel）和單核苷酸變異（SNP）為主［16-17,33-35］。

從Badh2基因型分布和基因頻率分析，badh2-E7（第7 外顯子8 bp 的缺失和3 個堿基的突變）是最常見的突變類型，廣泛分布在世界主要稻米生產國，如著名香秈稻KDML105 和Basmati370、美國香粳稻Della、我國優質稻花香2 號、廣東絲苗米代表品種美香占2 號和象牙香占等均為這種單倍型，表明在較早的香稻育種過程中，這種單倍型被育種家無意識選擇并廣泛應用。其余14 種單倍型具有較強的地域分布特性，相應的香稻品種數量較少，且多在粳稻中被發現，如江蘇的南粳系列均為badh2-E2.1單倍型，浙江和廣西的香糯稻為badh2-E4-5單倍型，這些香味基因型可能受特殊地理限制，形成了特色香稻品種。此外，多項研究發現Badh2基因啟動子區域變異也能夠導致2AP 積累（表1），目前共發現4種單倍型［36-39］，主要表現為Badh2基因5′ UTR相應序列缺失。分子功能研究表明，這些材料中2AP 的積累是由于BADH2 蛋白含量顯著下降引起的。

充分利用香稻資源中豐富多樣的Badh2單倍型進行常規雜交育種，一方面能規避轉基因風險，另一方面可能創制出不同香味類型的香稻品種。當前，對大多數Badh2單倍型已開發出特定的分子標記，不僅可以用于篩選香稻基因型，而且在香稻的分子輔助育種進程中發揮重要作用［34-35］。

1.3 不同Badh2 單倍型香稻的2AP 含量分布特征

不同Badh2突變類型材料中的2AP 含量不同（表1），BADH2 蛋白活性是影響2AP 積累的重要因素之一。通過對Badh2基因啟動子變異的香稻材料、RNAi 轉基因香稻材料的分析，發現BADH2 蛋白水平顯著降低［28,40］；Kovach等［16］研究發現，發生1 個或2 個堿基插入或缺失的單倍型材料（如badh2-E1、badh2-E10.1、badh2-E14.1）的2AP 含量整體高于單堿基替換或3 bp 插入的單倍型材料（如badh2-E10.3、badh2-E13.1、badh2-E14.2），表明2AP 含量與BADH2 蛋白活性密切相關，但對于BADH2 蛋白活性下降到何種程度才能導致2AP 積累這個問題尚未研究。另外，相同Badh2 單倍型材料之間，2AP 含量仍然存在較大差異，這與遺傳背景不同直接相關。

表1 香稻Badh2 基因突變類型Table 1 Type of alleles of Badh2 in aromcotic rice

目前，研究Badh2單倍型與2AP 含量關系最大的障礙在于缺乏遺傳背景相同、Badh2變異類型不同的遺傳材料，而利用CRISPR/Cas9 對非香稻Badh2的不同外顯子、啟動子區段設計靶點，獲得不同變異類型的香稻材料，能有效解釋Badh2單倍型與2AP 含量之間的關系，同時也是對高積累2AP 香稻創制的有益探索。

2 2AP 生物合成通路及其在香稻籽粒中的分布特征

2.1 2AP 代謝通路相關研究

不同香稻品種、不同栽培條件均導致2AP 含量差異，這與2AP 生物合成通路相關代謝物的變化密切相關。BADH2 能夠催化4-氨基丁醛氧化，從而生成4-氨基丁酸，而香味基因失活時，4-氨基丁醛能夠直接環化生成1-吡咯啉，1-吡咯啉再與乙酰基團結合，無需酶促反應即可合成2AP［41-42］，研究發現，1-吡咯啉是2AP 合成中重要的限制性底物［43］。根據1-吡咯啉的來源不同，2AP 生物合成途徑主要分為谷氨酸-脯氨酸代謝和多胺代謝兩種途徑［18,20,44］，如圖1 所示，谷氨酸和脯氨酸分別在脯氨酸脫氫酶（ProDH）和1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）的作用下，生成中間產物1-吡咯啉-5-羧酸（P5C），P5C 繼而轉化為1-吡咯啉；多胺代謝能夠生成中間產物4-氨基丁醛，4-氨基丁醛在BADH2 酶失活的情況下環化為1-吡咯啉。

圖1 2AP 生物合成通路示意圖Fig.1 Schematic diagram of the 2AP biosynthetic pathway

當前，對谷氨酸-脯氨酸代謝途徑的研究主要集中在脯氨酸含量以及P5CS、ProDH兩個關鍵基因表達變化對2AP 積累的影響方面。Huang等［45］研究發現，香稻中P5CS 酶活顯著高于非香稻；在Badh2啟動子區段變異的香稻“Velchi”中脯氨酸含量、P5CS 轉錄水平和酶活均高于非香稻［39］；在香稻中過表達P5CS，籽粒中2AP 含量可提高2 倍［46］。同時，增香栽培研究大多關注谷氨酸-脯氨酸通路對2AP 含量的影響：Mo 等［47］對香稻遮光處理后，脯氨酸含量顯著提高，2AP含量提高59%；Bao 等［48］對抽穗期香稻進行水分干濕灌溉處理，相關籽粒中ProDH、P5CS 和二胺氧化酶（DAO）活性顯著提高，2AP 含量提高了45%；適當的水氮調控及鋅、硒等處理［49-51］均可提高谷氨酸-脯氨酸代謝途徑活性從而提高2AP 含量。但目前的關鍵問題在于尚無直接證據證實植物體內P5C 能夠轉化為1-吡咯啉，從而制約了對籽粒2AP 含量的精準調控。

多胺在植物生長和發育過程中起重要的調控作用［52-53］，同時在多種逆境脅迫中發揮重要作用，如冷害、熱害、鹽脅迫和病蟲害等［54-57］；已有研究表明，多胺參與水稻籽粒灌漿的調控，對籽粒充實度、稻米品質、種子活力等均有影響［58-60］，腐胺、精胺和亞精胺等多胺物質經酶催化最終能夠生成4-氨基丁醛［61-62］，但多胺物質與籽粒2AP 積累的相關性研究未見報道。因此，加強香稻籽粒發育過程中多胺代謝對2AP 含量的影響機制研究，挖掘多胺途徑中調控2AP 含量的關鍵代謝物和關鍵基因，將有助于實現籽粒2AP 含量的定向提高。

2.2 香稻籽粒中2AP 分布特征及積累機制研究

精米中2AP 含量一般明顯低于糙米，但不同品種籽粒精米中2AP 分布特征差異較大。Buttery等［63］發現巴斯馬蒂香米、KDML105 籽粒中約35%的2AP 分布于精米；應興華等［64］研究發現桂香絲糯、清香米、泰國香稻1 號R207 等5個香稻品種精米中2AP 含量占比在90%以上。Yoshihashi 等［65］推斷精米中2AP 與淀粉顆粒復合體緊密結合，但籽粒中2AP 積累機制尚不明確，目前提出兩種機制加以解釋：一種認為葉片和鞘中合成的2AP 被轉運至籽粒，另一種認為2AP 在籽粒中被從頭合成。研究胚乳發育過程中2AP 代謝通路變化特性，對于認識籽粒2AP 積累機制、培育2AP 高積累水稻至關重要。Hinge 等［20］研究發現，隨著籽粒成熟2AP 含量不斷提高，但籽粒中脯氨酸含量較低，P5CS基因表達水平下降，從而認為籽粒中2AP 是由葉片轉運而來，但該研究未考慮多胺代謝對2AP 的影響；潘陽陽等［66］利用代謝組和轉錄組聯合分析技術，對美香占2號乳熟期、蠟熟期和完熟期的籽粒2AP 代謝通路進行分析，發現3 個時期籽粒中均含有2AP 生物合成所需的前體物質，同時，P5CS、ProDH以及多胺代謝途徑中二胺氧化酶4（DAO4）、多胺氧化酶4（PAO4）、精胺合成酶和亞精胺合成酶等相關基因具有持續較高的表達水平，推測谷氨酸-脯氨酸轉化通路和多胺代謝途徑均有助于2AP 的積累。因此，從籽粒動態發育角度研究影響2AP積累的相關代謝物和相關基因具有較高可行性，將成為揭示2AP 積累機制的重要手段。進一步加強胚乳中特異高表達的DAO4、PAO4等基因對2AP 含量影響的研究，對于特異提高精米中2AP含量具有重要意義。

3 展望

隨著水稻功能基因組學的發展，香稻資源中Badh2基因單倍型得以深入挖掘，不同單倍型香稻材料之間2AP 含量存在較大差異；2AP 生物合成通路也被初步解析，但其中多數基因的生物學功能尚未研究，對2AP 如何在籽粒中積累這一關鍵問題仍然缺乏系統認識。利用當前新興的代謝組、轉錄組、蛋白質組等多層組學技術，綜合研究香稻籽粒發育過程中2AP 相關代謝物和基因的變化特性，尤其是重點關注多胺代謝途徑的相關變化，挖掘關鍵調控基因，將有助于認識籽粒2AP 積累機制。因此，未來香稻的研究可以聚焦以下兩個方面：（1）解析不同香稻類型2AP 代謝通路的差異，重點解析多胺代謝對2AP 含量的影響機制；（2）加強不同類型Badh2單倍型香稻資源中DAO4、PAO4等基因的利用，培育2AP高積累的香稻品種。