水稻種子TTC 染色及萌發特性研究

陳兵先，張 琪，戴彰言，高家東，張文虎，吳柔賢，宋松泉，劉 軍

（廣東省農業科學院農業生物基因研究中心/廣東省農作物種質資源保存與利用重點實驗室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】水稻是我國最重要的糧食作物之一。隨著我國農業種植模式的改變和人工成本的不斷增加，直播稻越來越受青睞。然而，直播稻栽培因省去了浸種、育苗等常規流程，對于種子的活力有更高的要求。因此，在水稻直播前對種子活力及生活力進行評判有助于優選高活力種子，這對于確保田間萌發率和成苗率顯得尤為重要。

【前人研究進展】種子活力是指在廣泛的田間條件下，種子能夠迅速、整齊地萌發并長成健壯幼苗的能力［1］。國際種子檢驗協會（International Seed Testing Association，ISTA）將電導率測定和加速老化試驗作為農作物種子活力檢測的推薦方法。這些方法雖然可靠性高，但試驗周期較長。種子的生活力是指種子的潛在發芽能力或種胚所具有的生命力，是種子預期能夠長成正常幼苗的潛在能力［2］。高活力的種子一定具有高的生活力，因此當生產上不能應用電導率測定和加速老化試驗對種子活力進行判定時，往往將四唑（Triphenyltetrazolium Chloride，TTC）法檢測種子生活力的結果作為評判種子活力的重要依據［3］。用于種子生活力檢測的TTC 染色法具有便捷、快速、靈敏等優點［4］，ISTA 和中國農作物檢驗規程建議將TTC 染色法列為種子活力測定的方法之一。然而，TTC 染色法具有不穩定、受制于種子類別和染色條件等特點，目前缺乏程序化、規范化的TTC 染色技術流程。因此，針對不同農作物種子的特征特性，開發一套適用于不同類別作物種子的TTC 染色技術對于種子生活力的檢測具有重要意義。

【本研究切入點】以秈型常規水稻R988 為材料，針對當前種子生活力檢測不規范、缺乏統一技術流程的現狀，以及種業市場對于種子生活力檢測的迫切需求，應用單因素試驗和正交試驗設計系統研究吸水時間、TTC 濃度、染色溫度和染色時間對于種子生活力的影響；并通過萌發率和酶活性分析水稻種子萌發過程生理指標的變化。【擬解決的關鍵問題】探討水稻種子TTC 染色方法中對生活力測定有顯著影響的因素，并從各因素中篩選適用于水稻種子生活力檢測的最佳水平，揭示水稻種子在吸水萌發過程中的特性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

秈型常規水稻R988 于2020 年早造種植于廣東省農業科學院白云試驗基地。種子收獲后置于廣東省農作物種質資源庫干燥間（溫度15℃，濕度15%）保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 水稻種子TTC 染色 所用試劑為2,3,5－氯代三苯基四氮唑（購于廣州鼎國生物技術有限公司），溶解液為pH7.0 磷酸緩沖液，配制成不同濃度的TTC 染色液。將經過凈度分析后飽滿的水稻種子去殼，于無菌水中預吸脹一定時間（100粒/重復），將預吸脹的種子撈出后用濾紙吸干表面水分，每100 粒種子加入30 mL TTC 染色液，在一定染色溫度下染色一定時間。染色結束后將種子用清水沖洗3 次，終止反應。染色后的種子采用體視顯微鏡觀察。

單因素試驗：設置單因素試驗研究種子吸水時間、TTC 濃度、染色溫度和染色時間對種子生活力的影響。（1）種子吸水時間試驗：采用濃度為1%TTC、染色溫度30℃、染色時間1 h，種子吸水時間分別設置為0、3、6、9、12 h 對水稻種子進行染色；（2）TTC 濃度試驗：采用吸水時間6 h、染色溫度30℃、染色時間1 h，TTC 濃度分別設置為0.1%、0.2%、0.5%、1%和2%對水稻種子進行染色；（3）染色溫度試驗：采用吸水時間6 h、1% TTC、染色時間1 h，染色溫度分別設置為20、25、30、35、40℃對水稻種子進行染色；（4）染色時間試驗：采用吸水時間6 h、1%TTC、染色溫度30℃，染色時間分別設置為0.5、0.75、1、1.5、2 h 對水稻種子進行染色。種子生活力按以下公式計算：

正交試驗：在單因素試驗結果基礎上，選取種子吸水時間、TTC 濃度、染色溫度和染色時間作為影響種子生活力測定準確性的主要因素，設計L9（34）正交試驗（表1），進一步優化水稻種子TTC 染色檢測方法。

表1 正交試驗的因素和水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.2 水稻種子萌發特性分析（1）種子萌發率測定：將每100 粒水稻種子置于9 cm×9 cm發芽盒中萌發，盒內鋪平兩層濾紙，加入20 mL無菌水。將發芽盒置于植物培養箱中，設置溫度為28℃、濕度為85%、光照強度為10 000 lx，光照和黑暗時長分別為16 h 和8 h。本試驗分析不同水量、溫度、光暗條件對水稻種子萌發的影響，只需改變某單一試驗條件，其他萌發條件均保持不變。種子萌發的標準為胚根≥2 mm。計算種子萌發率。

（2）種子生理指標測定：取吸脹48 h 的水稻種子胚，4 次重復，每個重復100 粒。淀粉酶活性測定參照《作物種子生理學實驗》［5］、可溶性糖含量測定參照《種子學實驗指南》［6］的方法進行。

采用Microsoft office 軟件和SPSS21 軟件進行數據處理分析。

2 結果與分析

2.1 水稻種子TTC 染色的差異分析

采用去除穎殼的水稻整粒種子進行TTC 染色，結果（圖1）只有種胚處被染色，而胚乳（包括糊粉層和淀粉型胚乳）均不能被染色。種胚被染色的種子主要分為5 種情況：整個胚染色較深、整個胚染色較淺、胚根被染色、胚芽被染色、盾片被染色。將種子沿種胚對稱縱切后，結果發現前4 種狀態下的種子其整個胚均能被較深程度地染色；而整粒未能被染色的種子以及僅盾片處被染色的種子，縱切半粒后的種胚也不能被染色。

圖1 水稻種子TTC 染色效果Fig.1 TTC staining effects of rice seeds

2.2 水稻種子TTC 染色單因素試驗結果

由表2 可知，種子染色前的吸水時間對種子染色率有較大影響。種子吸水時間0 h，即干種子時，染色率僅為53%，吸水種子的染色率明顯高于干種子的染色率，吸水3 h 以上的染色率均大于70%，吸水12 h 的染色率達到80%。

表2 胚染色率與種子吸水時間的關系Table 2 Relationship between staining rate of embryo and seed imbibition time

由表3 可知，TTC 濃度對于染色率也有較大影響，主要體現在高低濃度的差別上，當TTC濃度≤0.2%時染色率不足60%，但當TTC 濃度≥0.5%時染色率沒有顯著差異，均在80%以上。

表3 胚染色率與TTC 濃度的關系Table 3 Relationship between staining rate of embryo and TTC concentration

表4 結果表明，染色溫度為20℃時，種子染色率僅為43%，隨著染色溫度的上升種子染色率也逐漸升高，但當溫度高于30℃時染色率升高趨勢趨緩。

表4 胚染色率與染色溫度的關系Table 4 Relationship between staining rate of embryo and staining temperature

表5 結果表明，種子染色時間可能對于染色率的影響更大，從染色0.5～2 h 這一過程中可見，染色率呈現直線上升的趨勢。

表5 胚染色率與染色時間的關系Table 5 Relationship between staining rate of embryo and staining time

基于單因素試驗結果，我們選用種子吸水時間、TTC 濃度、染色溫度和染色時間作為正交試驗設計因素，并從單因素的多個試驗梯度中各選用3 個水平，以期篩選最佳的染色組合方案。

2.3 水稻種子TTC 染色正交試驗結果

由表6 可知，在不同因素與水平組合處理下，水稻種子染色率（種子生活力）介于52%～95%之間，存在較大差異。其中以第4 組合試驗即吸水時間6 h、0.5% TTC、染色溫度30℃和染色時間2 h 條件下的種子生活力最高，種胚完全染色占72.5%，種胚染色較淺或僅胚根、胚芽染色占22.5%，總染色率高達95%，明顯優于其他組合；而第1 組合試驗即吸水時間3 h、0.5%TTC、染色溫度25℃、染色時間0.5 h 條件下的種子生活力最低，能夠完成染色的種子數僅為15%，大部分為不能染色和染色較淺的種子。對各試驗組得到的染色率進行方差分析，結果表明，試驗設定的4 個因素，吸水時間（A）和TTC 濃度（B）的P值分別為0.036 和0.024，說明吸水時間和TTC 濃度對種子染色結果有顯著作用；而染色溫度（C）和染色時間（D）的P值均小于0.01，達到極顯著差異水平，表明這兩個因素對于種子染色結果有更重要的作用。

表6 水稻種子TTC 染色正交試驗結果Table 6 Results of orthogonal test for TTC staining of rice seeds

進一步對正交試驗數據進行極差分析，結果表明，4 個因素的極差值分別為RA=2.9，RB=3.1，RC=17.5，RD=26.8。因此，4 個因素對于水稻種子生活力的影響依次為：染色時間（D）＞染色溫度（C）＞TTC 濃度（B）＞吸水時間（A）。可見在利用TTC 方法對水稻種子進行染色時，染色時間最為重要，而種子吸水時間影響最小。由于各因素所對應極差的最大值可代表最適合測定水稻種子生活力的條件，綜合上述結果，則可以得出水稻種子染色的最佳條件為：吸水時間3 h、TTC 濃度1%、染色溫度30℃、染色時間2 h。利用該最佳組合對同一批水稻種子染色，平均染色率為95.5%，稍高于正交試驗中的最佳試驗組合。

2.4 不同萌發條件下水稻種子萌發率變化

溫度、水分、光照和氧氣是決定種子萌發最重要的因素［7］。由圖2 可見，水稻種子在35℃下萌發最快，25℃下萌發最慢，種子萌發4 d（96 h）的萌發率分別為82%和72%。不同溫度條件并未對萌發7 d（168 h）的萌發率產生顯著影響，25～35℃下的萌發率均超過90%。

圖2 水稻種子在不同溫度下的萌發率Fig.2 Germination rate of rice seeds at different temperature

圖3 結果表明，光照對于水稻種子萌發的影響在萌發48 h 前未產生顯著影響，之后萌發過程被光促進，萌發率在暗條件下略有降低，表明光照條件可以加速水稻種子萌發。

圖3 水稻種子在光照和黑暗條件下的萌發率Fig.3 Germination rate of rice seeds under light or dark conditions

種子吸水是完成萌發最關鍵的先決條件，水量多少決定種子的萌發速率和質量，比如大豆種子萌發不需要太多水分，浸種次數越多反而萌發率降低［8］。研究表明，水稻種子隨著水量的增加，萌發速率和萌發率逐漸升高（圖4），這可能是由于水稻的水生特性所決定的。

圖4 水稻種子在不同水量條件下的萌發率Fig.4 Germination rate of rice seeds imbibed in different water amounts

2.5 不同萌發條件下水稻種子淀粉酶活性和可溶性糖含量變化

水稻的淀粉酶是一類水解種子內淀粉，并參與赤霉素轉運的重要水解酶，一向被認為與水稻種子萌發密切相關［9］。在不同溫度下吸脹萌發時，α-淀粉酶的活性隨著溫度上升逐漸升高，β-淀粉酶活性在25℃和30℃時無顯著差異，相比之下，35℃萌發溫度卻顯著提高了β-淀粉酶在種子胚中的活性（圖5）。與黑暗環境下萌發的種子相比，光照顯著提高了水稻種子胚中α-淀粉酶和β-淀粉酶的活性（圖6）。在10、20 mL 水中吸脹的水稻種子，α-淀粉酶和β-淀粉酶的活性沒有明顯變化，然而隨著水量的逐漸增加，兩種淀粉酶的活性也逐漸升高（圖7）。不同吸脹條件下，淀粉酶活性的變化趨勢與水稻種子萌發率的變化幾乎一致，表明α-淀粉酶和β-淀粉酶是參與水稻種子萌發的關鍵水解酶。

圖5 水稻種子在不同溫度下萌發48 h 的胚中淀粉酶活性Fig.5 Amylase activity in embryos of rice seeds germinated at different temperature for 48 h

圖6 水稻種子在不同光照環境下萌發48 h 的胚中淀粉酶活性Fig.6 Amylase activity in embryos of rice seeds germinated under light and dark conditions for 48 h

圖7 水稻種子在不同水量下吸脹48 h 的胚中淀粉酶活性Fig.7 Amylase activity in embryos of rice seeds imbibed in different water amounts for 48 hours

種子中可溶性糖通常被認為可為種子萌發和幼苗生長提供能量，因此在種子萌發和幼苗建成階段可溶性糖呈現逐漸上升的趨勢［10］。研究表明，可溶性糖含量在光照條件下較高；種子萌發水量的增加以及萌發溫度的升高均能顯著增加可溶性糖在種子胚中的含量（圖8）。這一結果與淀粉酶在種胚內的變化以及萌發率的結果一致。

圖8 水稻種子在不同萌發條件下的可溶性糖含量Fig.8 Soluble sugar contents of rice seeds under different germination conditions

3 討論

應用TTC 染色檢測種子生活力對于快速檢驗植物種子的質量具有重要的指導意義［2,11］。因此，國際種子檢驗規程以及我國農作物種子檢驗規程均將其作為檢測種子生活力及種子活力的重要參考［4,12］。本研究將去殼的水稻種子浸于TTC 溶液中染色時，有部分種子的胚可以被染成深紅色，但也有部分種子的胚染色較淺或只有胚芽或胚根被染色，它們均被認為是具有生活力的種子，因為將其種胚縱切后發現，它們的胚也能夠完全被染色，這可能是由于TTC 染液不容易被部分種子胚吸收或種子生活力較低所致。然而萌發試驗結果表明，胚完全染色和部分染色的種子均具有較高的萌發率。因此，我們將染色程度為整個胚染色較深、整個胚染色較淺、胚根被染色、胚芽被染色的種子歸為具有生活力的種子；而種胚完全不能被染色或僅有盾片部分被染色的種子，被認為是喪失生活力的種子，它們也無法完成萌發。需要注意的是，TTC 染色也具有一定的局限性，該方法只能區分具有生活力的種子和無生活力的種子，卻無法區分休眠種子和破眠種子［4,13］。本試驗所使用的水稻種子是在完全打破休眠后投入使用的，因此種子生活力百分率與萌發率幾乎一致。對于有休眠特性的種子，建議將TTC 染色與種子萌發率檢測的結果作為參考使用。

正交試驗設計常被廣泛應用于種子TTC 染色的最佳因素和水平篩選和優化上［14-16］。水稻種子染色正交試驗的極差分析和方差分析結果表明，種子吸水時間、TTC 濃度、染色溫度和染色時間4 個因素均能顯著影響水稻種子染色效果。其中染色溫度和染色時間對于染色效果的影響達到極顯著水平，表明這兩個因素是決定水稻種子TTC 染色效果最關鍵的因素。這一結果與應用TTC 溶液染色油桐［17］和南京椴［18］種子的生活力檢測結果相似，即染色溫度和染色時間對于種子染色更為重要。

一些禾谷類作物的種子在萌發過程中，淀粉酶的活性逐漸升高，植物激素脫落酸和赤霉素分別抑制和促進種子萌發也是通過影響α-淀粉酶的活性來實現的［9,19-21］。本研究進一步豐富了前人的研究結果。比如隨著加水量增加、溫度升高，淀粉酶的活性和種子萌發均呈現逐漸上升的趨勢。可溶性糖作為淀粉酶水解淀粉的產物，其含量變化與前兩者的變化趨勢也一致，表明水稻種子在逐漸萌發過程中由于淀粉酶逐漸升高，導致可溶性糖含量也逐漸升高，從而為種子萌發和幼苗建成提供能量和營養［22-23］。

4 結論

對于水稻種子而言，TTC 染色是一種可靠、便捷的種子生活力檢測方法，按照對水稻種子染色的影響程度，依次為染色時間、染色溫度、TTC 濃度和吸水時間。TTC 染色水稻種子的最佳條件為：染色時間2 h，染色溫度30℃，TTC 濃度1%，吸水時間3 h。采用該條件對試驗中同批次水稻種子染色，平均染色率為95.5%。在不同吸脹條件下，α-淀粉酶、β-淀粉酶活性和可溶性糖含量的變化與種子萌發率的變化呈現相同趨勢，或可作為預測和評價種子活力或萌發能力的重要生理指標。