4 種常見經濟濾食性貝類攝食活動對球等鞭金藻產生二甲基硫化物的影響*

侯 興 王 穎 劉天紅 杜美榮 高亞平 姜娓娓 李鳳雪 董世鵬 李文豪 蔣增杰,4①

(1. 中國水產科學研究院黃海水產研究所 農業農村部海洋漁業可持續發展重點實驗室 山東 青島 266071；2. 上海海洋大學水產與生命學院 上海 201306；3. 山東省海洋生物研究院 山東 青島 266104；4. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室 山東 青島 266071)

二甲基硫(DMS)是海洋中重要的揮發性生源硫 化物，被認為是一種“負溫室氣體”，其進入大氣的氧化產物增加大氣云凝結核的數量，提高云層對太陽光的反射率，使全球熱量收入減少，進而緩解全球氣候變暖(Charlsonet al, 1987)。二甲基巰基丙酸(DMSP)是DMS 的重要前體物質，其主要分布在浮游植物和大型藻類中，是滲透壓調節物質(Kirst, 1996)。浮游植物通過浮游動物攝食、微生物的新陳代謝、病毒侵蝕、藻細胞的衰老等途徑在 DMSP 裂解酶作用下產生DMS (Daceyet al, 1986; Malinet al, 1994; 楊桂朋等,2009; Belvisoet al, 1990;Christakiet al, 1996)。其中，浮游動物攝食作用是導致DMS 產生的重要途徑，浮游植物細胞中DMSP 和DMSP 裂解酶分別處在不同細胞隔室內，浮游動物攝食使分隔的DMSP 和DMSP裂解酶在其食物液泡中得以混合，從而促進DMS 的釋放(張瑜, 2013)；另外，浮游植物細胞內的DMSP 不易通過正常的細胞膜滲透到細胞外，經浮游動物攝食作用使浮游植物細胞破裂，促進了DMSP 的釋放，造成了DMSP 和酶的相互作用(Daceyet al, 1986)。Wolfe等(1996)研究認為，浮游動物攝食促進了浮游植物細胞中DMSP 裂解酶的活性，從而促進DMS 的釋放。

我國是海水養殖大國，貝類占海水養殖總產量的70%以上，其中，牡蠣(Ostrea gigas)、蛤、扇貝和貽貝(Mytilus edulis)等濾食性貝類占貝類總產量的90%以上(中國漁業統計年鑒, 2019)。濾食性貝類與浮游動物生態位相似，食物來源均以浮游植物為主，通過鰓絲和其上著生的前纖毛、前側纖毛、側纖毛的相互配合攝取食物顆粒(董波等, 2000)，濾食性貝類攝食活動對浮游植物產生二甲基硫化物[DMS(P)]可能存在重要影響，然而，目前有關濾食性貝類、浮游植物、DMS(P)三者之間作用關系的研究較少，僅有Hill 等(2007)研究了靜水條件下，紫貽貝(Mytilus edulis)和海灣扇貝(Argopecten irradians)攝食扁藻(Tetraselmissp.)對 DMS(P)的影響。本研究以長牡蠣(Crassostrea gigas)、櫛孔扇貝(Chlamys farreri)、紫貽貝、菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum) 4 種主要經濟濾食性貝類為研究對象，以DMSP 含量較高的球等鞭金藻(Isochrysis galbana)作為餌料藻種，探討了靜水和擾動條件下，水體的DMS(P)變化以及貝類糞便DMS(P)釋放的影響，研究結果將為深入探討貝類攝食活動對海洋硫循環的影響提供數據支撐，并拓展氣候變化背景下養殖貝類生態功能的認識。

1 材料與方法

1.1 實驗藻種和貝類

實驗所用球等鞭金藻由中國水產科學研究院黃海水產研究所微藻培養實驗室提供。采用脫脂棉過濾后的滅菌自然海水，pH 為8.0，鹽度為35，使用f/2培養液，將藻液置于光照培養箱中培養至指數生長期待用。光暗周期為12∶12，培養溫度為18℃，每天輕搖2 次，使用血球計數板測定微藻密度。

實驗貝類選用長牡蠣、櫛孔扇貝、紫貽貝、菲律賓蛤仔，殼長分別為 6.5～7.6、6.0～6.8、5.6～6.4、3.0～3.3 cm，放于水溫為18℃流水池中充氧暫養，每天投喂2 次金藻。預實驗結果顯示，貝類攝食作用會導致糞便DMSP 的產生，因此，在正式實驗前進行饑餓處理24 h。選擇規格相似、活性良好的貝類，除去體表附著物，對于紫貽貝和櫛孔扇貝2 種具有足絲的貝類，將其足絲沿貝殼邊緣小心剪除。

1.2 靜水條件下，攝食對金藻產生DMS(P)的影響

1.2.1 不同濃度餌料實驗 為了探究貝類攝食不同濃度的金藻對水體DMS(P)的影響，選用紫貽貝作為實驗貝類，將指數生長期的金藻稀釋，分成濃度分別為2×105、3×105、4×105和5×105cells/mL 進行投喂。

選用5.6 L 高約30 cm 的聚乙烯塑料桶作為實驗容器，向其中加入藻液至滿，水溫為18℃時向實驗組容器底部放入1 個貽貝，以不添加貽貝組作為對照組，并向其中充入等量的微量O2，保證溶解氧(DO)＞8.0 mg/L，氣石置于貝類上方，確保貽貝進行正常的攝食活動并不擾動糞便。向液面頂部覆蓋保鮮膜以盡量避免與外界接觸，攝食過程避光進行。每組設置3 個平行。通過預實驗得知，饑餓處理的貝類并不會增加去DMS 海水的DMS(P)濃度。

實驗以貽貝開始攝食計時，持續21 h。實驗結束后，在無擾動的條件下，虹吸上層水體約1 L，測定DMS、總DMSP(DMSPt)、溶解態DMSP(DMSPd)濃度和顆粒態DMSP(DMSPp)。使用均質儀將剩余含貝類糞便的少量水體(100～200 mL)混勻，測定糞便DMSP(DMSPf)濃度。通過預實驗得知，對照組DMSPp在21 h 內變化很小，被攝食DMSPp采用對照組和實驗組DMSPp的差值表示(下同)。

1.2.2 不同貝類攝食實驗 為了探討不同貝類攝食金藻對水體DMS(P)的影響，選擇長牡蠣、櫛孔扇貝、紫貽貝、菲律賓蛤仔作為實驗貝類，投喂與1.2.1中相同批次濃度為4×105cells/mL 的金藻。采用相同的實驗條件和測定方法。

1.3 擾動條件下，糞便對水體DMS(P)產生的影響

為了探究擾動條件下貝類糞便對水體DMS(P)的影響，選擇紫貽貝作為攝食貝類，貝類及金藻與1.2.1中批次相同，在1.2.2 靜置攝食實驗結束后，取出紫貽貝，選用貝類攝食后的水體，進行原水總水體擾動實驗；另選平行組進行定量糞便擾動實驗。

1.3.1 原水總水體擾動實驗 使用數顯恒溫磁力攪拌器(85-2 型, 丹瑞)，設定5 個擾動速度0 (對照組)、15、70、200、500 r/min，對原水總水體(糞便及水體)進行5 min 擾動處理。整個實驗期間，水溫未出現明顯升高現象，始終穩定在18℃～19℃之間，測定各組實驗前后的DMS、DMSPt和DMSPd的濃度，每組各設置3 個平行。

1.3.2 定量糞便擾動實驗 將上層水體虹吸移除，僅保留糞便，使用改裝后的一次性塑料滴管小心移取，使用分析天平稱量5 份0.08 g 紫貽貝糞便，分別置于2 L 聚乙烯塑料桶中，加入1 L 經高溫滅菌處理后的去DMS 海水，使用數顯恒溫磁力攪拌器，設定5 個擾動速度0 (對照組)、15、70、200、500 r/min，對水體進行5 min 擾動處理。整個實驗期間，水溫未發生明顯變化，始終穩定在18℃～19℃之間，測定各組DMS、DMSPt和DMSPd的濃度。

1.4 二甲基硫化物分析

1.4.1 檢測方法建立及工作曲線繪制 使用固相微萃取-氣相色譜與質譜聯用法(solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry)測定DMS，具體操作方法及工作曲線繪制如下：

QP2010SE 氣相色譜與質譜聯用儀(島津，日本)搭配 AOC-5000 自動進樣器(CTC)，使用 60 m ×0.32mm 1.8 μm Vocol 色譜柱(Supleco)進樣口溫度為210℃，使用分流模式，分流比為7.5∶1，離子源溫度為 200℃，載氣為高純氦氣(99.999%)，流速為3mL/min，進樣時間為1 min，柱前壓為85.0 kPa，柱箱溫度為35℃，保持3 min 后，以3℃/min 的速率升到40℃，保持1 min 后，以10℃/min 的速率升到100℃，再以20℃/min 的速率升到210℃，保持10 min，溶劑延遲時間為1 min，MS 檢測器電壓為100 eV，檢測和數據采集選擇SIM 模式，質荷比m/z 選擇47和62。萃取溫度為24℃，萃取時間為20 min，解析時間為 2 min，使用Carboxen/Polydimethylsiloxane(CAR/PDMS)萃取纖維(75 μm, Supleco)。

將DMS 標準品(色譜純，Sigma-Aldrich)加入甲醇(色譜純，ThermoFisher 公司，美國)中，配制成1.0 g/L的標準儲備液，-20℃避光保存。繪制工作曲線時，取10.0 mL 去DMS 海水裝于預先加入2.5 g NaCl (分析純)的20.0 mL 頂空瓶中，再加入一定量的DMS 儲備液配制成一系列濃度的標準品，擰緊瓶蓋，使用外標法定量并繪制標準曲線。在10～100,000 ng/L 的范圍內均展現出良好的線性，方法的性能參數見表1。

表1 方法的性能參數Tab.1 Performance parameter of SPME-GC/MS

1.4.2 樣品分析 DMS 的分析：待測樣品采取與DMS 標準品同樣的操作方法，吸取10 mL 待測樣品注入到裝有2.5 g NaCl 的頂空瓶中，擰緊瓶蓋，放于自動進樣器中待測。

DMSP 的分析：DMSP 在強堿作用下(pH≥13)會按1∶1 的比例完全轉化為DMS 和丙烯酸(Daceyet al,1987)，故通過測定DMS 含量即可間接得到DMSP 的含量。DMSP 樣品(濃度過高時進行稀釋)分成2 份，取10 mL DMSP 樣品直接加入預先裝有2.5 g NaCl 的頂空瓶中，加入0.5 mL 10.0 mol/L 的NaOH，密封玻璃瓶，4℃避光保存24 h，使DMSP 完全堿解為DMS，通過測定DMS 含量間接得到DMSPt的含量；另一份DMSP 樣品經0.45 μm Whatman GF/F 濾膜進行小體積重力過濾(SVDF)(Kieneet al, 2006)，濾液使用相同處理方法測定DMSPd。DMSPp由DMSPt減去DMSPd得到。DMSPf測定步驟同DMSPt，注意扣除水體DMS和DMSPt濃度。

1.5 數據處理與分析

數據處理和柱狀圖繪制采用Excel 2016 軟件，差異顯著采用SPSS 19.0 分析軟件。

2 結果與分析

2.1 靜水條件下，貝類攝食金藻對DMS(P)產生的影響

2.1.1 靜水條件下，貽貝攝食不同濃度金藻對DMS(P)產生的影響 從圖1 可以看出，不同濃度餌料實驗中，金藻濃度分別為2×105、3×105、4×105、5×105cells/mL，實驗組和對照組的DMS 濃度分別為(177.93±7.42)和(181.83±8.50)、(240.33±9.50)和(230.03±10.05)、(299.09±9.67)和(297.17±12.00)、(391.93±17.04)和(384.69±16.06) nmol/L。與對照組相比，實驗組的DMS 變化范圍在97.0%～104.6%之間，差異不顯著(P＞0.05) (圖1a)。

DMSPd實驗組和對照組的濃度分別為(27.93±11.24)和(36.10±16.15)、(45.33±17.00)和(40.38±15.73)、(39.67±18.44)和(30.33±19.73)、(45.01±14.11)和(45.33±11.50) nmol/L。各實驗組均并未有顯著的升高或者降低現象(P＞0.05)，且無論對照組還是實驗組，相對于DMSPp，DMSPd的濃度較低，約為DMSPp的1% (圖1b)。

DMSPp實驗組和對照組的濃度分別為(40.99±40.29)和(3234.83±208.90)、(81.97±91.06)和(4908.58±318.25)、(97.58±55.29)和(6503.17±458.98)、(968.67±463.19)和(8220.42±302.08) nmol/L。與對照組相比，實驗組DMSPp濃度均呈顯著降低趨勢(P＜0.01)，且貝類的攝食百分比越高，對應的DMSPp降低程度越大(圖1c)。

DMSPf分 別 為 1305.8、 1421.8、 3259.6、2507.5 nmol/L，分別占據攝入 DMSPp的 40.9%、29.5%、50.9%和34.6% (圖1d)。貽貝攝食量分別占投喂總量的99.0%、98.7%、99.0%和87.2% (圖1e)。

圖1 貽貝攝食不同濃度金藻對DMS(P)產生和轉移的影響Fig.1 Effects of mussel feeding on I. galbana at different concentrations on production and transfer of DMS(P)

2.1.2 靜水條件下，不同貝類攝食金藻對DMS(P)產生的影響 從圖2 可以看出，對于DMS，在牡蠣、貽貝、扇貝、蛤仔的攝食下，實驗組濃度分別為(288.17±12.35) 、 (299.01±9.55) 、 (305.17±17.23) 、(310.97±10.55) nmol/L，對照組DMS 濃度為(297.17±12.00) nmol/L，與對照組相比，實驗組的DMS 變化范圍在 97.0%～104.6%之間，差異不顯著(P＞0.05)(圖2a)。

DMSPd實驗組濃度分別為(20.33±18.02)、(39.67±18.43)、(26.01±14.19)、(28.67±30.33) nmol/L，對照組濃度為(30.33±19.74) nmol/L。各實驗組中均并未有顯著的升高或者降低現象(P＞0.05)，無論對照組還是實驗組，相對于DMSPp，DMSPd的濃度較低，約為DMSPp的1% (圖2b)。

DMSPp實 驗 組 濃 度 分 別 為(23.36±24.74)、(60.33±17.50)、(78.67±28.02)、(3433.44±451.09) nmol/L，對照組為(6304.2±384.32) nmol/L。與對照組相比，實驗組DMSPp濃度均極顯著降低(P＜0.01)，并且貝類的攝食百分比越高，對應的DMSPp濃度降低程度越大(圖2c)。

牡蠣、貽貝、扇貝和蛤仔組DMSPf濃度分別為2510.8、3467.8、3604.5 和1200.5 nmol/L，分別占據了攝入DMSPp的40.0%、55.5%、57.9%和41.8% (圖2d)。

牡蠣、貽貝、扇貝和蛤仔組攝食量分別占投喂總量的100.0%、99.0%、99.70%和49.4% (圖2e)。

圖2 不同貝類攝食金藻對DMS(P)產生和轉移的影響Fig.2 Effects of feeding on I. galbana by different bivalves on production and transfer of DMS(P)

2.2 擾動條件下，貝類糞便對水體DMS(P)產生的影響

2.2.1 原水總水體擾動 不同擾動程度對原水總水體DMS(P)的影響見圖3。從圖3 可以看出，在0、15、70、200 和500 r/min 轉速下，原水總水體DMS分別為(302.21±11.59)、(318±11.11)、(345.07±15.31)、(353.09±18.02)和(349.57 ±14.05) nmol/L。隨著擾動程度的增加，DMS 濃度均有增加的現象，其中，70、200 和500 r/min 組與對照組相比差異顯著(P＜0.05)，擾動能促進糞便中DMS(P)的釋放而導致水體DMS 濃度顯著增加，最大可使原水總水體DMS 增加16.8%(圖3a)。

原水總水體DMSPd濃度分別為(38.01±19.08)、(29.98± 22.00)、(46.99±23.10)和(41.07±19.00) nmol/L，擾動處理下，與對照組相比均未出現顯著的升高或者降低現象(圖3b)。

原水總水體DMSPf濃度分別為58.32、672.91、2200.40、2305.82 和2641.28 nmol/L，隨著水體擾動程度的增加，糞便向水體的擴散量增加，DMSPt濃度逐漸增加，最大可使原水總水體DMSPt增加38.5 倍(圖3c)。

圖3 不同擾動程度對原水總水體DMS(P)的影響Fig.3 Effects of different disturbance velocity on total original water DMS(P)

2.2.2 定量糞便擾動 不同擾動程度水體中DMS(P)濃度變化情況見表2。從表2 可以看出，在0～500 r/min 轉速范圍內，隨著擾動程度的加強，水體中DMS 和DMSPt的濃度均呈現升高的趨勢，二者的濃度分別從靜置狀態下的7.6 和906.4 nmol/L 升高到最大21.3 和2505.9 nmol/L，分別增加了180%和174%。

表2 不同擾動速度下糞便水體中DMS(P)濃度變化Tab.2 Variation of DMS(P) concentration in fecal water with different disturbance velocity

3 討論

自Dacey 等(1986)首次通過室內橈足類攝食鞭毛藻(Gymnodinium nelson)的研究表明，浮游動物對浮游植物的攝食作用可促進水體中DMS 的增加，已有眾多研究得到了類似的結論(Belvisoet al, 1990; Lecket al,1990; Christakiet al, 1996; 張瑜, 2013)。Kasamatsu等(2004)研究指出，浮游動物的“Sloppy feeding”攝食方式，使其攝食過程中對浮游植物細胞攝食不完全，機械破碎導致DMS 的產生。與上述結果不同，Kwint等(1996)在橈足類近親真簾水蚤(Eurytemora affinis)攝食浮游三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)和威氏海鏈藻(Thalassiosira weissflogii)研究中發現，橈足類的攝食活動并未導致水體中的DMS 增加，DMSP幾乎均以糞便顆粒的形式排出，進一步分析表明，浮游動物攝食最重要的作用是將浮游植物中的DMSP轉移到糞便顆粒中。Hill 等(2007)對靜水條件下，紫貽貝和海灣扇貝攝食扁藻(Tetraselmissp.)的研究也表明，濾食性貝類的攝食活動對微藻DMS 的釋放未產生明顯的促進作用，這與本研究結果相一致。產生這種現象的原因可能與濾食性貝類的攝食機制有關，貝類通過選食器官(鰓、唇瓣、食物選擇盲囊)完成食物顆粒的收集、運輸、截取和篩選后，進入消化道進行消化吸收，未消化的食物顆粒以糞便形式排出體外(董波等, 2000)，這種攝食機制使得浮游植物以被鰓分泌黏液包裹的形式進入消化器官內完成同化，同時，排出的糞便也被代謝產生的黏液包裹，使得靜水條件下，糞便中的DMS(P)難以通過固-液界面形成擴散，由此導致靜水條件下，水體中DMS 沒有出現顯著增加的現象。對于紫貽貝和櫛孔扇貝等具有足絲的貝類來說，除了攝食活動是影響水體DMS 濃度因素外，足絲腺分泌的足絲蛋白極強的吸附作用也是可能的因素之一。凌文康等(2019)研究表明，紫貽貝足絲分泌的足絲蛋白對海水中的重金屬等化學物質具有很強的吸附能力，但關于足絲蛋白吸附作用與DMS 遷移和轉化之間潛在的關系目前尚未見相關報道，值得在后續的研究進一步深入探討。在靜水實驗中發現，糞便中約占據了貝類攝入DMSPp的40%，如此高的含量可能對水體DMSP 和DMS 產生潛在的影響。濾食性貝類通過生物沉積過程在水環境和沉積環境之間發揮著生物耦聯作用。在廣島灣牡蠣養殖區，一臺200 m2筏架在300 d 養殖期內可產生19.3 t 糞物質(干重)。Hatcher 等(1994)在加拿大的一個封閉海灣觀察到貽貝養殖區的沉積速率是非養殖海區的2 倍以上；在煙臺四十里灣，殼高為41.1 mm 的櫛孔扇貝生物沉積速率最高達230 mg/(g·d)(周毅等, 2003)。穩定碳氮同位素的研究結果表明，長牡蠣生物沉積物對沉積物有機質的貢獻率平均為(13.96±8.62)% (任黎華,2014)。濾食性貝類養殖活動的主要區域在淺海，由于受到海底地形、區域構造環境、徑流、海洋環流等影響，淺海的環境復雜而多變(尹燕欣, 2012)。擾動實驗發現，隨著糞便中DMSP 的擴散，水體中DMSPt和DMS 的量增加。在總水體擾動實驗中，相比對照組，實驗組DMS 和DMSPt濃度最大分別增加了16.8%和38.5 倍。同時海區調查也發現，在近岸海域Niel海灣(Jean, 2009)、威尼斯瀉湖(Gambaro, 2002)甚至白令海海盆西南部海域的深層海水中(＞2000 m) (Liet al,2007)均具有很高的DMS(P)濃度，高DMS(P)含量的沉積物再懸浮和擴散作用可能是誘發此現象的原因。在這樣的背景下，僅僅基于實驗室內的靜水實驗結果將大大局限對于DMS(P)生物地球化學過程的認識，這也是本研究嘗試開展一定程度擾動實驗的出發點和落腳點。對于養殖海區來說，外界環境對生物沉積物的擾動作用主要有2 個過程：一個過程是在生物沉積物向海底沉降的過程中。研究表明，中等規格(5.46±0.54) cm 的長牡蠣生物沉積物的平均沉降速率約為(1.16±0.54) cm/s (任黎華, 2014)。以桑溝灣的平均水深為7 m 來估算，需要10 min 到達海底，在此過程中，浪、流等作用導致生物沉積物破碎、擴散、懸浮，生物沉積物與水體接觸的比表面積增大，接觸時間延長，使沉積物-水界面得到充分的物質交換。另一個過程發生在沉降到海底的生物沉積物的再懸浮作用。王丕波等(2005)研究表明，在淺水區海底沉積物再懸浮更為顯著，風浪、潮汐、潮流等因素引起的海水運動是重要誘因。以我國典型濾食性貝類養殖海灣桑溝灣為例，沉積物再懸浮通量的數量級在10-5～10-6kg/(m2·s)之間，全年約有171 d 沉積物處于再懸浮狀態(蔣增杰, 2008)；淺水湖Apopka 湖每年70%時段有50%沉積物受到風浪擾動而懸浮(蔣增杰,2008)，如此頻繁且強烈的再懸浮作用使生物沉積物中的DMS(P)有了向水體中再次釋放的機會。

本研究雖然獲得了貝類通過生物沉積物再釋放過程對DMS(P)如DMS、DMSPt濃度有一定影響的一些數據和線索，但是并未發現DMSPd濃度顯著增加現象。DMSPd轉化時間較快，本身濃度變化并不明顯，加之DMSPd的測定方法為間接法測定，這些因素均可能是此結果的原因。最后，本研究的結論是基于室內可控條件下，模擬獲得的養殖海區的水文條件。實際水環境條件等極為復雜，相應的DMS(P)的產生和遷移轉化過程也更為復雜，研究結果向海區的拓展和應用尚需要后續開展一系列現場圍隔等形式的野外觀測研究進行綜合解讀。