固相微萃取-氣質聯用法測定魚肉中土臭味素和2-甲基異莰醇*

張艷紅 李德祥 張鳳枰① 鄒昌健

(1. 四川威爾檢測技術股份有限公司 四川 成都 610041；2. 通威股份有限公司水產畜禽營養與健康養殖農業農村部重點實驗室 四川 成都 610093；3. 通威股份有限公司水產健康養殖四川省重點實驗室 四川 成都 610093)

水產品是人類食品中優質動物蛋白的主要來源之一。我國是水產養殖第一大國，2019 年全國水產品總產量為6450 萬t，其中，養殖產量為5050 萬t。然而，部分養殖水產品的土腥味令消費者很難接受，是困擾水產養殖業已久的問題，直接影響到水產品的消費和養殖經濟效益。據研究，土臭味素(geosmin,GSM)和2-甲基異莰醇(2-methylisoborneol, 2-MIB)是易引起水產品肉質產生土腥味最常見的2 種化合物，是放線菌(Actinomycetes)、藍藻(Cyanobacteria)、細菌(Bacteria)和真菌(Fungi)等微生物的次級代謝產物在萜烯合成酶的作用下產生的，參與這些生物合成的酶和基因最早是在鏈霉菌(Streptomyces)上發現的，后來也在藍藻中發現(Caneet al, 2006; Dickschatet al,2007; Ludwiget al, 2007)。研究表明，人體對土臭味素和2-甲基異莰醇的嗅覺閾值分別為0.9 和0.6 μg/kg(Robertsonet al,2005; Persson, 1980)；水體中4～10 ng/L的土臭味素和9～42 ng/L 的2-甲基異莰醇就能使水體及水產品產生異味；當魚肉組織中的這2 種化合物濃度超過0.7 μg/kg 時，就不再適合零售(徐立蒲, 2009)。國內外相關研究人員采用臭氧(薛勇, 2006; 杜國偉,2006; Schraderet al, 2010; 王國超, 2012; Zhanget al,2016)、乙酸(Lindholm-Lehtoet al, 2019)、調節水質(Schraderet al, 2010; 王賽, 2012)和暫養(楊玉平,2010)等方法脫除或降低養殖水產品中的土腥味物質。目前，有關土臭味素和2-甲基異莰醇等的測定方法主要為感官分析法(Grimmet al, 2004; Howgate,2004; Robinet al, 2006)、氣相色譜法(Howgate, 2004)和氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS) (陳依萍等, 2020)。GB/T 32470-2016 (張振偉等, 2016)規定了頂空固相微萃取-氣相色譜質譜聯用法測定生活飲用水及其水源水中的土臭味素和2-甲基異莰醇。相關研究(張婷等,2009; 王國超等, 2011; Denget al, 2012; 周夢海,2015)報道了采用微波蒸餾－固相微萃取－氣相色譜質譜聯用法測定鯰魚(Silurus asotus)、羅非魚(Oreochromis mossambicus)肌肉中的土臭味素和2-甲基異莰醇。Ruan 等(2013)采用攪拌棒吸收萃取-熱脫附-氣相色譜質譜聯用法(SBSE-TD-GC-MS)測定大西洋鮭(Salmo salar)肌肉中的土臭味素和2-甲基異莰醇含量，土臭味素加標回收率達93%～96%，但2-甲基異莰醇加標回收率僅為23%～30%，不滿足檢測需求。為準確測定水產品中的土臭味素和2-甲基異莰醇含量，本研究采用頂空固相微萃取法(headspace solid-phase microextraction, HS-SPME)提取魚肉中的土腥味物質，以順式-十氫-1-萘酚為內標、氣相色譜質譜聯用法進行定性和定量測定，旨在建立魚肉中土臭味素和2-甲基異莰醇的檢測方法，為養殖水產品異味物質脫除提供檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑和材料

7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀，G1701EA質譜工作站：Agilent公司，美國；T10 均質儀，IKA公司，德國；SPME手柄、65 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，Sigma-Aldrich公司，美國；DF-Ⅱ集熱式磁力加熱攪拌器，江蘇金壇市醫療儀器廠；40 mL頂空瓶，上海安譜科學儀器有限公司；LD6100-1 電子天平，沈陽龍騰電子有限公司。

100 μg/mL 土臭味素和2-甲基異莰醇混和標準溶液，順式-十氫-1-萘酚標準物質：Sigma-Aldrich公司，美國；甲醇：色譜純；水為Milli-Q Gradient去離子水。

肌肉樣品：鯽魚(Carassius auratus)、烏魚(Channa argus)、羅非魚、草魚(Ctenopharyngodon idellus)、斑點叉尾(Ictalurus punctatus)、花鰱(Aristichthys nobilis)、鯉魚(Cypriniformesspp) 和武昌魚(Megalobrama amblycephala)，在四川省成都白家水產品批發市場購買，隨機取10 尾，均為健康鮮活個體，樣品采集后立即裝袋、充氧，0.5 h 后運送到實驗室，致死后取肌肉部分，去皮后切成2～3 cm 肉片，用均質儀打成肉糜，置于密封袋中，并于-80℃超低溫冰箱中冷凍保存，分析時取出流水解凍后使用。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 準確稱取樣品10 g (精確至0.1 g)于40 mL 頂空瓶中，加入1 μg/mL 順式-十氫-1-萘酚溶液10 μL 作為內標，加入10 mL 去離子水，用均質器均質3 min，將樣品完全破碎，放入微型攪拌子，備用。

1.2.2 頂空固相微萃取提取土臭味素和2-甲基異莰醇 萃取頭老化：第一次使用DVB/CAR/PDMS 萃取頭時，需置于氣相色譜進樣口250℃下老化2 h (氮氣保護下)；之后使用時，需在250℃下處理30 min，以確保脫去可能吸附的揮發性成分。

SPME 提取：將裝有樣品的頂空瓶置于磁力攪拌臺上，于60℃水浴中平衡10 min，將SPME 針管插入頂空瓶中(含65 μm/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭，使用前于250℃下處理30 min，以確保脫去可能吸附的揮發性成分)，固定萃取頭在頂空瓶中的位置，攪拌速度為1000 r/min 左右，頂空萃取30 min 后取出，迅速插入氣相色譜儀的進樣口，解吸5 min，使SPME纖維頭涂膜吸附的揮發性成分在高溫下迅速熱解吸，即可通過GC-MS 進行分析鑒定。

1.2.3 土臭味素和2-甲基異莰醇標準工作溶液

0.1 μg/mL 土臭味素和2-甲基異莰醇混合標準儲備液：準確移取100 μL 100 μg/mL 土臭味素和2-甲基異莰醇混合標準溶于100 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋、定容，搖勻，備用。

1 μg/mL 順式-十氫-1-萘酚內標儲備液：準確稱取順式-十氫-1-萘酚標準物質10 mg 于1000 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋、定容，搖勻，備用。

土臭味素和2-甲基異莰醇混合標準系列工作液：稱取10 g 去離子水于40 mL 頂空瓶中，加入10 mL 去離子水，分別加入10、20、50、100、200 和1000 μL 0.1μg/mL 土臭味素和2-甲基異莰醇混合標準儲備液，10 μL 1 μg/mL 順式-十氫-1-萘酚內標儲備溶液，搖勻，得到濃度分別為0.1、0.2、0.5、1、2 和10 μg/L土臭味素和2-甲基異莰醇系列標準工作液。

1.2.4 儀器工作條件 色譜柱：HP-5 ms 彈性毛細管柱(30.00 m × 0.25 mm × 0.25 μm)；程序升溫：柱初溫60℃，保持4 min，然后以8.5℃/min 升至200℃，保持15 min，以20℃/min 升至250℃，保持2 min；進樣口溫度250℃；載氣：He，流量1.0 mL/min；解吸溫度250℃，解吸時間5 min，不分流模式進樣。

傳輸線溫度260℃；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電子能量70 eV。掃描方式：SIM 選擇性離子掃描；土臭味素掃描離子為125、112 和97；2-甲基異莰醇的掃描離子為135、108 和95；順式-十氫-1-萘酚的掃描離子為136、94 和121。

1.2.5 標準工作曲線繪制和樣品分析 按照上述色譜質譜條件和方法，進行GC-MS 分析，以標準液中被測組分的峰面積和內標峰面積的比值為縱坐標，以標準液中被測組分的濃度和內標濃度的比值為橫坐標繪制標準工作曲線。在相同條件下測定樣品，從標準工作曲線上求得樣品中土臭味素和2-甲基異莰醇的含量。

2 結果與討論

2.1 提取方法的選擇

國內外有關土臭味素和2-甲基異莰醇的提取方法主要有微波蒸餾－固相微萃取、頂空固相微萃取和攪拌棒吸收萃取-熱脫附等(張婷等, 2009; 王國超等,2011; Denget al, 2012; 周夢海, 2015; 張振偉等,2016)。微波蒸餾提取需對微波萃取功率、微波蒸餾時間和載氣氣流等參數進行確認，由于微波萃取所用的儀器大多為家用微波爐，不同品牌和型號的微波爐使用功率不一致，很難統一微波萃取功率和固化實驗條件。前期準備實驗時發現，魚肉中含有70%～80%的水分，微波萃取時，魚肉中的水分汽化為水蒸氣，在載氣吹掃和冷凝水冷卻雙重作用下，水蒸氣在管道中冷凝下來，附著在冷凝管上，影響土臭味素和2-甲基異莰醇的收集，導致回收率偏低，多次實驗結果的重復性、穩定性差。本方法選擇頂空固相微萃取提取土臭味素和2-甲基異莰醇，稱取樣品后加入等體積的超純水均質，采用60℃頂空固相微萃取法對目標化合物進行提取和富集，該前處理操作簡單、易標準化，加標回收實驗、實際樣品測定結果表明，采用該提取方法具有良好的重現性，可滿足魚肉中土臭味素和2-甲基異莰醇的檢測需求。

2.2 固相微萃取條件的選擇和優化

2.2.1 萃取頭的選擇 Sung等(2005)對土臭味素和2-甲基異莰醇提取過程中萃取頭的選擇進行了研究，分析了PDMS、PDMS/DVB、PA、CAR/PDMS、CW/DVB和DVB/CAR/PDMS等6 種不同吸附材質對水中土腥味物質的吸附效果。結果表明，DVB/CAR/PDMS對土臭味素和2-甲基異莰醇的萃取效果最好，實驗最終選擇DVB/CAR/PDMS作為土臭味素和2-甲基異莰醇提取的萃取頭。

2.2.2 NaCl 的選擇 固相微萃取中，一般來說，加入NaCl 將獲得較高的萃取效果，但由于魚肉樣品揮發性風味成分較多，加入NaCl 會導致魚肉中多種易吸附的揮發性成分吸附于萃取頭，使萃取頭容易達到飽和，從而減少土臭味素和2-甲基異莰醇的吸附，降低土臭味素和2-甲基異莰醇的回收率，最終影響土臭味素和2-甲基異莰醇的準確定量，纖維頭的壽命也會因此顯著下降，比較實驗結果見圖1。實驗最終選擇萃取過程中不添加NaCl。

圖1 未加入NaCl 和加入NaCl 總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms without/with NaCl

2.2.3 攪拌速率對萃取效果的影響 設定攪拌時間30 min，萃取溫度為60℃，考察攪拌速度分別為300、600、900、1200、1500 和2000 r/min 對萃取效果的影響，實驗結果見圖2。結果表明，土臭味素和2-甲基異莰醇的回收率隨著攪拌轉速的增大而增大，當攪拌速率達到1500 r/min 之后，回收率基本趨于穩定。實驗最終確定攪拌速率為1500 r/min。

圖2 不同攪拌轉速對加標回收率的影響(n=3)Fig.2 Effects of different stir speeds on recovery rate (n=3)

2.2.4 萃取時間 實驗以65 μm DVB/CAR/PDMS為實驗用萃取頭。萃取溫度均設置為60℃，平衡10 min后，吸附時間選取20、30 和40 min，考察土臭味素和2-甲基異莰醇的加標回收率，結果見圖3。結果顯示，30 和40 min 吸附時間的回收率明顯高于20min，30 和40 min 的回收率相接近。綜合比較，萃取時間30 min 為最佳。

圖3 不同萃取時間對加標回收率的影響(n=3)Fig.3 Effects of different extraction time on recovery rate (n=3)

2.2.5 萃取溫度 萃取溫度對萃取結果有兩方面影響，一方面溫度升高有利于土臭味素和2-甲基異莰醇的揮發，增加吸附量；另一方面，溫度升高時，其余干擾物質吸附增加，從而減少目標化合物吸附量。選取萃取時間為30 min，設置40℃、60℃和80℃對實驗結果的影響，以考察土臭味素和2-甲基異莰醇的加標回收率，結果見圖4。結果表明，萃取溫度為60℃時，加標回收率最高。

圖4 不同萃取溫度對加標回收率的影響(n=3)Fig.4 Effects of different extraction temperature on recovery rate (n=3)

2.3 定量方法的選擇

由于土臭味素和2-甲基異莰醇為半揮發性物質，不穩定，易損失。本研究采用外標法和內標法(順式-十氫-1-萘酚)開展加標回收實驗，結果見圖5。結果顯示，外標法的回收率在40.6%～46.7%之間，內標法回收率在70.6%～72.3%之間，內標法的回收率明顯高于外標法。因此，選擇內標法作為魚肉中土臭味素和2-甲基異莰醇含量的測定方法。

圖5 外標法和內標法對加標回收率的影響(n=3)Fig.5 Effects of external standard method and internal standard method on recovery rate (n=3)

實驗選用了2-異丁基-3-甲氧吡嗪和順式-十氫-1-萘酚2種與目標化合物化學性質相似、沸點相近的內標物進行加標回收實驗。結果顯示，用順式-十氫-1-萘酚作為內標物，土臭味素和2-甲基異莰醇回收率分別為71.2%和69.1%；而用2-異丁基-3-甲氧吡嗪作為內標物，土臭味素和2-甲基異莰醇回收率分別為57.3%和48.9%。因此，選擇順式-十氫-1-萘酚作為內標物。

2.4 線性范圍、檢出限和定量限

土臭味素和2-甲基異莰醇混合標準系列工作液分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 和10.0 μg/L，順式-十氫-1-萘酚(內標)的濃度均為1 μg/L 時進樣測定。以標準液中被測組分的峰面積和內標峰面積的比值為縱坐標，以標準液中被測組分的濃度和內標濃度的比值為橫坐標，繪制標準工作曲線，并分別計算、驗證最低檢出濃度(S/N=3.0，P/P)、最低定量濃度(S/N=10.0，P/P)。土臭味素和2-甲基異莰醇GC-MS 總離子流圖見圖6，線性范圍、回歸方程、相關系數、檢出限和定量限等結果見表1。

表1 土臭味素和2-甲基異莰醇的線性范圍、回歸方程、相關系數、檢出限和定量限Tab.1 Regression equations, correlation coefficients (r2), detection limits and quantification limits for geosmin and 2-methylisoborneol

圖6 土臭味素、2-甲基異莰醇和順式-十氫-1-萘酚(內標)標準液總離子流圖(5.0 ng/mL)Fig.6 Total ion chromatogram of 5.0 ng/mL geosmin, 2-methylisoborneol and cis-decahydro-1-naphthol standard solution

2.5 精密度實驗

表2 精密度實驗結果Tab.2 Results of precision test

2.6 回收率實驗

對鯽魚和羅非魚進行加標實驗，并計算回收率，結果見表3。從表3 可以看出，土臭味素的加標回收率為68.67%～80.30%，2-甲基異莰醇的加標回收率為62.67%～83.40%，相對標準偏差均小于10%。由此可見，該方法能較準確測定魚肉中土臭味素和2-甲基異莰醇的含量。

表3 回收率實驗結果(n=3)Tab.3 Spiked recovery of different feed material samples (n=3)

2.7 實際樣品測定

為考察方法的適用性，在水產市場上購買鯽魚、烏魚、羅非魚、草魚、花鰱、鯉魚和武昌魚進行土臭味素和2-甲基異莰醇測定實驗，每個樣品重復測定3 次，結果見表4，草魚實際樣品檢測總離子流圖見圖7。7 種魚類的土臭味素的含量為0.179～0.306 μg/kg，2-甲基異莰醇的含量為0.222～0.531 μg/kg。在實際樣品測定中，目標化合物和內標物分離良好，無干擾峰，可滿足魚肉中土臭味素和2-甲基異莰醇的定性定量測定。

圖7 草魚樣品總離子流圖Fig.7 Total ion chromatogram of geosmin,2-methylisoborneol, and cis-decahydro-1-naphthol in extract solution of grass carp

表4 7 種實際樣品測定結果Tab.4 Quantification determination results for 7 fish muscle samples

3 結論

由于魚肉中揮發性風味物質成分復雜、種類繁多，風味物質的檢測一直備受關注。土腥味物質作為一類影響魚肉品質的揮發性成分，提取和吸附難度大，干擾物質繁多，其檢測難度較大。本方法選擇頂空固相微萃取技術作為土腥味物質的提取和富集方法，前處理方法簡單，不使用有機溶劑，不對環境造成污染。稱取魚肉樣品后加入等體積的超純水，均質，

將魚肉中的土臭味素和2-甲基異莰醇溶解于水相中，經頂空固相微萃取對目標物進行提取和富集，以順式-十氫-1-萘酚為內標物，通過GC-MS 定量分析，可減少檢測過程中其他風味成分對土臭味素和2-甲基異莰醇的干擾，達到完好分離，方法精密度均小于5%，土臭味素的加標回收率為68.67%～80.30%，2-甲基異莰醇的加標回收率為62.67%～83.40%，相對標準偏差均小于10%，表明該方法可滿足魚肉中土臭味素和2-甲基異莰醇的定量檢測需要，可作為養殖水產品異味物質脫除檢測方法。