維生素B7 和B12 對細菌生物被膜形成及厚殼貽貝幼蟲變態的影響*

楊金龍 段志鴻 丁文揚 徐嘉康 顧忠旗 梁 簫①

(1. 上海海洋大學 國家海洋生物科學國際聯合研究中心 上海 201306；2. 上海海洋大學 水產種質資源發掘與利用教育部重點實驗室 上海 201306；3. 南方海洋科學與工程廣東省實驗室 廣東 廣州 511458；4. 浙江省嵊泗縣海洋科技研究所 浙江 舟山 202450)

厚殼貽貝(Mytilus coruscus)為一種具備較高營養的經濟貝類(Wanget al, 2012; 徐嘉康等, 2017)，常見于東海、黃海和渤海沿岸海域，主產區為浙江舟山東海海域，其養殖生產已發展了十幾年，年度平均養殖數目高達50～60 億粒以上(王如才等, 1998; 羅友聲等,2003)。但近年來，由于貽貝養殖區域劃分不規范、各級管理存在缺陷、貽貝災害頻發等問題，造成厚殼貽貝資源衰退(王靖陶等, 2010)。為了恢復和發展厚殼貽貝的野生資源，陸地工廠化人工育苗、海區增殖放流、貽貝海洋牧場養殖示范區建設等技術與產業迅速發展起來(張義浩等, 2003; ?？姑? 2007; 羅海忠等, 2016)。厚殼貽貝在其生活史中必須經歷從浮游生活階段過渡到附著生活階段的變態發育過程，才可長成成貝(Wanget al, 2012)。附著變態后的貽貝也可通過切斷其足絲的方式，尋找新的適宜環境進行二次附著(李太武, 2013)。因此，如何提高厚殼貽貝幼蟲的附著變態率就成為其增養殖相關產業發展的核心技術問題。

研究表明，由海洋細菌所形成的生物被膜可以實現對大部分海洋無脊椎動物幼蟲附著變態情況的調節(楊金龍等, 2012)。例如，假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)的某些細菌(Uhlingeret al, 1983;Holmstr?met al, 1999)可形成對厚殼貽貝(Yanget al,2013)和華美盤管蟲(Hydroides elegans) (Shikumaet al,2014)等幼蟲附著變態具有顯著誘導作用的生物被膜。生物被膜的形成受許多因素的影響(Yanget al,2014、2016a、2016b)。其中，對生物機體生理生化有影響的鈣、鐵離子等營養素會導致海洋細菌形成的生物被膜的形態結構、分布和蛋白含量具有差異，并影響厚殼貽貝的附著(孫俊杰等, 2016; 常睿珩等,2020)。

B 族維生素作為一類有機物質，廣泛存在于自然環境中，是維持生物體生命活動的重要活性物質(Degnanet al, 2014)。它能夠調控大多數細菌的生理和生化反應，例如糖代謝、脂代謝、蛋白代謝和DNA合成等，從而影響生物體生長發育(Woodset al, 1953;王春華等, 2011; 王雅平等, 2019; 周瑩等, 2020)。研究表明，B 族維生素通過影響布魯桿菌屬(Brucella)和沙門菌屬(Salmonella)細菌的主要營養物質代謝等生理生化反應進而調控細菌生物量(Matras, 1973)；B族維生素可顯著促進海蠕蟲(Capitella teleta)幼蟲附著變態(Burnset al, 2018)。其中，維生素B7(VB7)和B12(VB12)以輔基或輔酶的形式參與機體的生理生化反應，調節新陳代謝并維持細胞、器官和組織結構和功能的完整，確保生命活動正常運行(Brown, 1989;Knowleset al, 1989; Ekhardet al, 1998)。但B 族維生素對海洋細菌生物被膜形成及海洋貝類幼蟲變態的影響尚不清楚。

本研究通過將厚殼貽貝眼點幼蟲直接暴露于VB7 和VB12 中，以及在對厚殼貽貝幼蟲附著變態具有高誘導活性的海假交替單胞菌(Pseudoalteromonas marina)生物被膜形成過程中添加VB7 和VB12，明確其對厚殼貽貝幼蟲附著變態的影響，探索B 族維生素、海洋細菌生物被膜形成和海洋貝類幼蟲變態三者間的相互關系，為解析厚殼貽貝附著變態分子機制提供新思路和理論依據。同時，也為B 族維生素應用于海洋牧場建設中人工魚礁礁體構造和厚殼貽貝人工養殖行業技術的完善提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

實驗所用的海假交替單胞菌分離自浙江省舟山市嵊泗縣海域(30°72′N、122°76′E)掛板形成的自然生物被膜，并儲存于-80℃超低溫冰箱中(Penget al,2020)。

1.2 實驗材料

實驗所用的VB7 和VB12 購于西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司。實驗中使用的厚殼貽貝幼蟲在2019 年中旬在浙江省某縣(30°69′N、122°46′E)采集。在實驗室環境中，以10 ind./mL 密度于鹽度30 的自然海水中暫養，每2 d 換水，每天投喂1×104cells/mL湛江等鞭金藻(Isochrysis zhanjiangensis)藻液，避光18℃充氣培養7 d 后進行實驗(梁簫等, 2020a)。

1.2.1 VB7 和VB12 直接誘導 將VB7、VB12 和通過殺菌處理過的海水相溶(autoclaved filtered seawater, AFSW)，并在此基礎上形成pH=7.6 的母液，將母液加入無菌培養皿(規格為64 mm×19 mm)中，并加適量AFSW 定容至20 mL，設立空白對照組和B族維生素終濃度為0.02、0.2、2 和20 mmol/L 的不同實驗組，每組設置9 個生物學重復。將20 只眼點幼蟲添加到無菌培養皿中，置于18℃避光環境中培養96 h。記錄12、24、48 及96 h 的幼蟲附著變態數量，通過運算獲得幼蟲附著變態率。

1.2.2 VB7和VB12 處理后海假交替單胞菌生長曲線繪制 參照朱艷蕾等(2016)方法測定處理后海假交替單胞菌生長曲線，取菌液(OD600nm約為1)，按1%接種量轉接至盛有300 mL 2216E 液體培養基的圓底燒瓶內連續培養，封瓶膜封口，不同培養時間取培養液，立即測定OD600nm值，每個時間點設置3 個生物學重復，以OD 值為縱坐標、培養時間為橫坐標，繪制生長曲線。

1.2.3 VB7和VB12 處理后海假交替單胞菌生物被膜制備 參照楊金龍等(2015)方法制備生物被膜，取儲存的海假交替單胞菌劃線于2216E 平板上，25℃培養12 h 后，挑取單菌落接種到2216E 液體培養基中，置于25℃避光條件下擴大培養。以3500 r/min 離心15 min，去除上清液，用AFSW 洗滌細菌沉淀3 次，最后定容至50 mL 制成細菌懸濁液，取1 mL 稀釋(細菌懸濁液∶AFSW=1∶99)后的菌液過濾至0.22 μm濾膜上，0.1%吖啶橙染色5 min，然后在熒光倒置顯微鏡(Olympus BX51)下觀察，計算細菌濃度。在裝有無菌載玻片的無菌培養皿中分別加入適量的菌液與VB7 和VB12 的混合物，加適量AFSW 定容至20 mL，并使細菌的初始濃度為5×108cells/mL，VB7 和VB12最終濃度為0 (對照)和0.02 mmol/L，每組設9 個生物學重復，避光18℃下培養48 h，以制備生物被膜。

1.2.4 幼蟲附著變態實驗 將附有生物被膜的載玻片轉移至20 mL AFSW 無菌培養皿中，并向培養皿中添加20 只眼點幼蟲，該實驗由空白(Blank, 無菌玻片)、腎上腺素(Epinephrine, EPI)、自然生物被膜(Bacterial biofilm, BF)這3 種對照組和實驗組(生物被膜)組成(Satuitoet al, 1999; Yanget al, 2008)。每組設置9 個生物學重復，避光18℃條件下記錄12、24、48 和96 h 幼蟲附著變態率(梁簫等, 2020b)。

1.2.5 生物被膜細菌密度計數 借鑒楊娜等(2017)提出的方法，記錄細菌密度值，并把生物被膜在5%的福爾馬林試劑內浸泡48 h，0.1%吖啶橙染色5 min，之后放到熒光顯微鏡(Olympus BX51)下計數細菌密度，每片生物被膜中隨機選擇10 個視野，每組設置3 個生物學重復。

1.2.6 生物被膜膜厚度分析 參照楊娜等(2017)的方法分析膜厚度，將生物被膜在5%的甲醛溶液中固定24 h，避光條件下5 μg/mL 碘化丙啶(PI)浸染處理20 min，之后通過1×PBS 進行多次清洗。并借助激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy, CLSM)展開詳細觀察，針對每組設置3 個生物學重復，并自由挑選出10 個視野進行成像分析，以確定生物被膜膜厚度。

1.2.7 生物被膜胞外產物分析 參照 González-Machado 等(2018)方法分析胞外產物。用0.9%生理鹽水清洗培養好的生物被膜3 次，通過相關試劑(表1)進行染色處理，該步驟需要在沒有光線的環境下操作20 min。之后通過0.9%的鹽水進行漂洗，并放在同樣沒有光線的環境中，待其干燥之后通過CLSM 顯微鏡詳細觀察，并自由挑選出10 個視野對其成像效果予以分析。每組設置3 個生物學重復。

表1 生物被膜胞外產物染色試劑Tab.1 Staining reagent of biofilm EPS composition

1.2.8 生物被膜可拉酸染色 參照楊金龍等(2015)的方法制備生物被膜，從載玻片刮下生物被膜，涂布在玻璃片上，然后風干、染色?？衫崛旧珔⒖糝en等(2016)的方法，將0.3 g 堿性品紅、90 mL 含5%苯酚和10 mL 95%乙醇混合制成品紅溶液，將玻璃片染色3 min。用媒染劑溶液[2.0 g/L KAl(SO4)2∶0.3 g/L FeCl3∶1.5 g/L 丹寧酸=5∶2∶2]染色3 min。最后，1%亞甲基藍溶液染色30 s。在每次染色之前，蒸餾水沖洗生物被膜以去除上一種染色液。細菌細胞染成紅色，可拉酸染成藍色。每組設置3 個生物學重復。

1.2.9 可拉酸定量 參考Obadia 等(2007)的方法定量可拉酸。從12 個生物被膜中收集細菌細胞，并將其懸浮在1 mL 蒸餾水中。100℃煮沸細菌10 min，13,000g離心15 min，棄去沉淀，收集上清液，定量可拉酸。加入4.5 mL H2SO4/H2O 溶液(6∶1)，于1 mL上清液中制成混合液，100℃反應20 min。冷卻至25℃，將2 mL 混合液用于檢測396 nm (A396co)和427 nm(A427co)吸光度。將100 μL 的3%(m/v)半胱氨酸鹽酸溶液與剩余混合液在25℃下避光孵育1 h 后，在396 nm (A396cy)和427 nm (A427cy)測吸光度。將(A396cy-A396co)-(A427cy-A427co)的值代入L-巖藻糖濃度標準曲線(10～100 μg/mL)計算可拉酸濃度。

1.3 數據統計與分析

使用JMP 軟件(ver.10.0.0)進行統計分析和相關性檢驗(Lianget al, 2020)。將幼蟲的變態率百分比轉化為反正弦以觀察正態分布情況，如果符合該現象，則需要通過單因素方法對其中的差異進行分析。反之，便需要進行Kruskal-Wallis 檢驗分析。Spearman多元分析方法用于幼蟲變態率與B 族維生素濃度及細菌密度之間的相關性分析，采用P為檢驗值，r為相關系數，顯著性水平設置為0.05。生物被膜胞外產物含量分析使用image 軟件。

2 結果

2.1 VB7 和VB12 對幼蟲變態的直接影響

圖1 顯示，0.02、0.2 mmol/L VB7 誘導幼蟲變態率分別為(28.33±0.83)%和(11.67±0.83)%，VB12 誘導幼蟲變態率分別為(13.89±1.39)%和(1.67±0.83)%，與空白對照組相比，均可顯著提高誘導厚殼貽貝幼蟲變態(P＜0.05)，其中以0.02 mmol/L 的誘導效果最好。而2、20 mmol/L VB7 的變態率分別為(5.56±1.30)%和(1.67±0.83)%，VB12 的變態率分別為(1.67±0.83)%和0%，與空白對照組相比，均出現顯著抑制作用(P＜0.05)，其中以20 mmol/L 濃度的抑制作用最強。

圖1 VB7 和VB12 對厚殼貽貝幼蟲變態的影響(72 h)Fig.1 Effects of VB7 and VB12 on larval metamorphosis in the mussel M. coruscus at 72 h

2.2 VB7 和VB12 對海假交替單胞菌生長的影響

對照組和處理組海假交替單胞菌在培養1 h 后進入生長對數期，6 h 后進入穩定期(圖2)。培養6 h時，OD600nm值分別為OD(P. marina)=0.9543、OD(P. marina+0.02mmol/LVB7)=1.0607 和OD(P. marina+0.02mmol/LVB12)=0.9923，相比于單一細菌的對照組，0.02 mmol/L 的VB7 和VB12在生長對數期對細菌生長均具有顯著影響(P＜0.05)。其中，VB7 對細菌生長的促進作用持續至穩定期，而VB12 在細菌生長9 h 后無明顯作用。

圖2 VB7 和VB12 處理后的海假交替單胞菌生長曲線Fig.2 Growth curve of P. marina after treatment with VB7 or VB12

2.3 VB7 和VB12 處理后海假交替單胞菌生物被膜對幼蟲變態的影響

圖3 顯示，由VB7 和VB12 與海假交替單胞菌形成的生物被膜誘導的幼蟲附著變態率顯著高于細菌單一生物被膜(P＜0.05)。0.02 mmol/L 濃度VB7 處理后，海假交替單胞菌生物被膜誘導幼蟲附著變態率為(71.0±3.9)%；0.02 mmol/L 濃度VB12 處理后的幼蟲附著變態率為(60.1±3.3)%，二者均顯著高于細菌單一生物被膜附著變態率(38.8±3.09)% (P＜0.05)。

圖3 VB7 和VB12 處理后的海假交替單胞菌生物被膜對厚殼貽貝幼蟲變態的影響(48 h)Fig.3 Effects on metamorphosis of post-larvae on the P.marina biofilms after treatment with VB7 or VB12 at 48 h

2.4 VB7 和VB12 處理后海假交替單胞菌生物被膜生物量的變化

圖4 顯示，初始濃度為5×108cells/mL 的海假交替單胞菌分別與VB7 和VB12 共同形成生物被膜，其細菌密度明顯高于細菌單一生物被膜(P＜0.05)，VB7 和VB12 處理后的生物被細菌聚集性增強(圖5)，且膜厚度顯著提高(P＜0.05)(圖6)。相關分析結果顯示，生物被膜所具備的細菌密度和膜厚度均與誘導活性具有極顯著相關性(P＜0.05)(表2)。

圖4 VB7 和VB12 處理后的海假交替單胞菌生物被膜細菌密度Fig.4 Density of P. marina biofilms after treatment with VB7 or VB12

圖5 激光共聚焦掃描電鏡下VB7 和VB12 處理后的海假交替單胞菌生物被膜形態Fig.5 CLSM reveals morphology of P. marina biofilms after VB7 or VB12 treatment

圖6 激光共聚焦掃描電鏡下VB7 和VB12 處理后的海假交替單胞菌生物被膜厚度Fig.6 CLSM reveals thickness of P. marina biofilms after treatment with VB7 or VB12

表2 生物被膜厚度和細菌密度與誘導活性的相關性分析Tab.2 Correlation analysis between biofilm thickness,bacterial density and inducing activity

2.5 海假交替單胞菌生物被膜胞外產物的變化

熒光染色顯示(圖7)，海假交替單胞菌單一生物被膜細菌呈顆粒狀分布，胞外產物分布較為均勻，而VB7 和VB12 處理后的生物被膜細菌多聚集狀態，胞外產物含量明顯升高，且多呈塊狀分布。

圖7 激光共聚焦掃描電鏡下VB7 和VB12 處理后的海假交替單胞菌生物被膜胞外產物Fig.7 CLSM reveals extracellular products of P. marina bacterial biofilms after VB7 or VB12 treatment

3 組生物被膜α 多糖、β 多糖、蛋白質和脂質含量見圖8。與單一生物被膜相比，VB7 處理后具有更高含量的α 多糖、β 多糖、蛋白質和脂質。其中，單一生物被膜的α 多糖含量僅為(1536.50±57.36) μm3，而VB7 處理后生物被膜的α 多糖含量為(800,590.25±46,499.65) μm3，上調了520 倍(P＜0.05)(圖8)。

2.6 處理后海假交替單胞菌生物被膜的可拉酸含量

染色結果顯示，相比于單一細菌生物被膜，VB7和VB12 處理后生物被膜可拉酸分布更密集(圖8)，且含量明顯提高(圖9)。單一細菌生物被膜可拉酸含量為(30.46±6.03) μg/mL，而VB7 和VB12 處理后含量分別為(215.78±24.18)和(158.27±23.27) μg/mL，升高了7.08 倍和5.20 倍(P＜0.05) (圖9)。

圖8 激光共聚焦掃描電鏡下VB7 和VB12 處理后的P. marina 生物被膜胞外產物含量Fig.8 CLSM reveals extracellular products of P. marina biofilms after VB7 or VB12 treatment

圖9 媒染劑染色生物被膜光學顯微鏡的觀察Fig.9 Light microscopic observation of mordant-stained biofilms

3 討論

3.1 B 族維生素對生物被膜形成的影響

B 族維生素作為生長輔助因子，以輔基或輔酶的形式參與機體的生理生化反應，調節新陳代謝，并維持細胞、器官和組織結構和功能的完整，是確保所有生命活動正常運行的重要營養物質(Brownet al, 1989;Knowleset al, 1989; Ekhardet al, 1998)。本研究的結果顯示，0.02 mmol/L 濃度下VB7 和VB12 與初始細菌濃度為5×108cells/mL 的P. marina共同形成生物被膜，與P. marina單一生物被膜相比，細菌密度和膜厚度顯著增加，細菌成聚集狀態，并產生大量的多糖等胞外產物。Matras(1973)研究表明，B 族維生素可通過影響布魯桿菌屬和沙門菌屬細菌的主要營養物質代謝等生理生化反應來調節細菌生物量。因此，推測B 族維生素的加入可以提高生物被膜的生物量和胞外產物含量，進而促進生物被膜的形成。

3.2 B 族維生素對幼蟲變態的影響

3.2.1 B 族維生素對幼蟲變態的直接影響 許多海洋無脊椎動物在發育為成體前處于浮游幼蟲階段。幼蟲的浮游階段可以短則幾分鐘，也可以長達幾個月。通常，海洋無脊椎動物幼蟲的附著變態主要受外界環境和內源性因素控制(Crisp, 1974; Pawlik,1992)，特別是外界環境因子對于幼蟲的附著變態至關重要(Morse, 1990; McClintocket al, 2001)。B 族維生素廣泛存在于自然環境中，并作為營養物質參與幼蟲的附著變態過程。Burns 等(2018)研究表明，B族維生素可通過影響海蠕蟲幼蟲的主要營養物質代謝水平進而提高幼蟲附著變態率。然而，關于B 族維生素與海洋貝類附著二者間的相互作用關系仍有待研究。

圖10 VB7 和VB12 處理后的P. marina生物被膜可拉酸含量Fig.10 Colanic acid production in P. marina biofilms after VB7 or VB12 treatment

研究結果顯示，0.02、0.2 mmol/L 濃度下VB7和VB12 的孵育均可以顯著誘導厚殼貽貝幼蟲變態。其中以0.02 mmol/L 濃度下的誘導作用較強，但2、20 mmol/L 濃度下VB7 和VB12 對幼蟲變態起抑制作用。因此，推測在一定濃度的條件下，B 族維生素可能通過增強幼蟲糖類、脂類和蛋白質代謝及免疫系統功能進而促進厚殼貽貝等海洋貝類幼蟲的附著變態。

3.2.2 生物被膜與幼蟲變態的關系 生物被膜生物量和胞外產物(胞外多糖、蛋白、脂質等)含量是影響海洋無脊椎動物附著的關鍵因素(Kirchmanet al,1981; Hadfieldet al, 2011)。研究表明，厚殼貽貝幼蟲附著變態和稚貝附著都受到細菌密度的影響(Wanget al, 2012; 楊金龍等, 2013; Yanget al, 2014)。厚殼貽貝與生物被膜相關性研究證實，細菌密度與附著變態呈顯著相關；自然生物被膜和胞外產物的群落結構對合浦珠母貝(Pinctada fucata)幼蟲附著具有十分關鍵的誘導功能(Yuet al, 2010)；海洋假單胞菌Strain S9所對應的生物被膜胞外多糖大幅度加快了海鞘(Cionaintestinalis)幼蟲附著變態(Szewzyket al,1991)。因此，推測厚殼貽貝幼蟲附著變態除了與B族維生素的直接誘導作用有關外，還可能與生物被膜的生物量和胞外產物含量有關。研究結果顯示，VB7和VB12 處理后的生物被膜顯著提高了厚殼貽貝幼蟲的附著變態率，其生物被膜的生物量和胞外產物含量顯著高于P. marina單一生物被膜，其中，胞外多糖含量升高520 倍。前期研究發現，多糖能夠誘導許多海洋無脊椎動物幼蟲附著變態(Kirchmanet al, 1982;Szewzyket al, 1991; Matsumuraet al, 1998;Khandeparkeret al, 2003; Baoet al, 2007; Zenget al,2015)，其中，最具代表性的是由生物學重復單元(葡萄糖、巖藻糖、半乳糖和葡萄糖醛酸)與α 鍵和β 鍵相連所組成的可拉酸(Whitfield, 2006; Schmidet al,2015)，可拉酸能在細菌周圍產生高度負電荷膠囊(Goebel, 1963; Allenet al, 1987)，并將吸附細菌周圍的礦物質和營養物質(Ophiret al, 1994)，促進具有誘導海洋無脊椎動物幼蟲附著變態活性的附著基的形成。實驗證明，P. marina細菌多糖相關基因缺失后，可拉酸的產生量增多，細胞內c-di-GMP 水平升高，c-di-GMP 水平的升高導致細菌運動能力降低，進而促進細菌粘附和生物被膜的形成，從而提高厚殼貽貝幼蟲的附著變態率(Whiteleyet al, 2015; Pérez-Mendozaet al, 2016; Penget al, 2020)。本研究結果顯示，VB7 和VB12 處理后生物被膜的生物量和胞外產物(可拉酸)含量均顯著升高，并均對厚殼貽貝幼蟲的附著變態存在顯著誘導作用。因此，推測B 族維生素可能通過協同c-di-GMP 調節可拉酸的產生，從而正調控生物被膜的形成和厚殼貽貝幼蟲的附著變態，但B 族維生素對c-di-GMP 水平的影響尚需進一步研究。這一發現為闡明生物被膜與幼蟲之間的相互作用提供了新的視角。

本研究首次發現，VB7、VB12 兩種B 族維生素對厚殼貽貝幼蟲變態具有直接誘導作用。同時，VB7和VB12 通過促進P. marina生物被膜的形成，增加生物被膜的細菌密度和膜厚度，提高生物被膜胞外產物含量，從而間接促進厚殼貽貝幼蟲的附著變態。本研究為探究厚殼貽貝幼蟲附著變態的分子機制提供了新的理論依據和創新思路，同時，為B 族維生素在提高厚殼貽貝人工育苗技術、改善厚殼貽貝養殖產業問題和海洋牧場建設等生態修復方面的應用提供了理論基礎。