櫛孔扇貝鰓細胞原代培養(yǎng)與B[α]P細胞毒性檢測技術(shù)的研究*

張子仙 田依萌 劉 志 潘魯青①

(1. 中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室 中國海洋大學(xué) 山東 青島 266003；2. 黃島出入境檢驗檢疫局 山東 青島 266555)

多 環(huán) 芳 烴(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)主要來源于有機物的熱解或不完全燃燒，作為一種持久性有機污染物，具有內(nèi)分泌毒性、神經(jīng)毒性、免疫毒性和生殖毒性等。 其中， 苯并(a)芘(benzo[a]pyrene, B[α]P)是致癌性最強的PAHs(朱利民等, 1993; 楊帆等, 2013)。隨著海上石油和輪船運輸業(yè)的快速發(fā)展和工農(nóng)業(yè)、生活污水的大量排放，海洋環(huán)境污染日趨嚴重。研究表明，大連海域、青島近岸海域、海口灣海水PAHs 污染含量分別為65～1130、8.23～272.02 和420.2～2539.1 ng/L(李先國等, 2012; Lietal, 2015)，我國近岸部分海域PAHs 已接近中等污染水平。

雙殼貝類分布廣泛，營濾食性生活，代謝率較低，對PAHs 有較強的生物富集作用，常被作為海洋污染監(jiān)測的指示生物(Birmelinet al, 1999; Faucetet al,2003; Gacicet al, 2014)。許多學(xué)者研究利用魚類組織細胞評估體外生態(tài)毒理風(fēng)險和監(jiān)測水域環(huán)境污染狀況(Fent, 2001; Bolset al, 2005)。已有學(xué)者將雙殼貝類原代培養(yǎng)的組織細胞用于增塑劑、重金屬等污染物的毒性評估和生物監(jiān)測，如4 種增塑劑對珠蚌(Unio pictorum)組織細胞毒性檢測方法的研究表明，中性紅比色法適于檢測雙酚A 對外套膜、鰓和性腺細胞的活性影響，MTT 比色法更適于檢測DiDP 對消化盲囊細胞的毒性(Yurdak?k-Dikmenet al, 2018)。重金屬對淡水貽貝(Lasmigona costata)鰓組織細胞的毒性檢測方法為臺盼藍排斥拒染法(Nogueiraet al, 2013)，由此說明污染物對貝類原代培養(yǎng)細胞毒性在檢測方法上存在差異。目前，貝類原代組織細胞培養(yǎng)剛剛起步，在組織(外套膜、鰓、消化盲囊和性腺)消毒處理和細胞分離制備等技術(shù)方面仍不夠完善(Daugavetet al,2015; Yurdak?k-Dikmenet al, 2018)。

櫛孔扇貝(Chlamys farreri)是我國淺海重要的經(jīng)濟貝類，基于雙殼貝類的生態(tài)習(xí)性，鰓組織作為直接與外界水環(huán)境接觸的呼吸、濾食器官，鰓細胞的活力、形態(tài)和受損程度可直接反映海洋環(huán)境污染狀況。本研究以櫛孔扇貝為研究對象，在已有雙殼貝類細胞培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上，優(yōu)化櫛孔扇貝鰓細胞的制備技術(shù)和原代培養(yǎng)條件，并采用3 種細胞活性檢測技術(shù)，比較分析B[α]P 對櫛孔扇貝鰓細胞的毒性作用，旨在為雙殼貝類原代細胞培養(yǎng)和海洋PAHs 毒性評估提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用櫛孔扇貝購于山東青島市沙子口貝類養(yǎng)殖場，殼高為(6.0±0.5) cm，暫養(yǎng)在塑料水槽中，海水鹽度為31，溫度為(18±1)℃，pH 為8.0，連續(xù)充氣，日換水量1/2，暫養(yǎng)密度為4～6 個/L，投喂螺旋藻(Spirulina)粉，日投餌量為軟體部鮮重的0.5%。暫養(yǎng)2 d 后，選取健康個體，去除貝殼表面附著物，置于經(jīng) 0.22 μm 濾膜過濾的海水中，加入適量雙抗(1000 U/mL 青霉素、1000 μg/mL 鏈霉素)，養(yǎng)殖2 d。

1.2 鰓細胞的制備

選取活力好的櫛孔扇貝，用過濾滅菌海水沖洗貝殼表面，參考郎剛?cè)A等(2000)的方法，用無菌脫脂棉蘸取75%酒精消毒貝殼，晾干。在超凈工作臺中，取鰓組織置于培養(yǎng)皿中，稱重，然后用過濾滅菌的海水沖洗數(shù)次(去除殘留的血細胞)，再用消毒液(由無菌海水、青霉素100 U/mL-鏈霉素100 μg/mL 雙抗和慶大霉素80 μg/mL 配制)沖洗鰓組織3 次，然后浸泡于消毒液中除菌。將浸泡后的鰓組織用CMFS (HEPEs 20 mmol/L、NaCl 500 mmol/L、KCl 12.5 mmol/L、EDTA 5 mmol/L、1%慶大霉素，pH=7.3，滲透壓=1100 mOsm)緩沖液沖洗3 次，置于CMFS 溶液中，將鰓組織剪至1～2 mm3小塊，將剪碎的組織塊轉(zhuǎn)移至等體積混合的CMFS 和胰蛋白酶(濃度為0.25%)中，26℃振蕩消化，加入適量的L15 培養(yǎng)基(10%胎牛血清、1%慶大霉素，pH=7.3，滲透壓=1100 mOsm)。將鰓細胞懸液先后經(jīng)400 目和150 目的滅菌金屬細胞篩過濾，離心5 min，棄上清液，加入不含血清的L15培養(yǎng)基，重懸沉淀，再次離心5 min，棄上清液，加入L15 培養(yǎng)基重懸，將細胞密度調(diào)整至1.2×105cells/mL ，接種至96 孔細胞培養(yǎng)板，置于26℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.3 鰓細胞原代培養(yǎng)方法優(yōu)化

1.3.1 消毒時間 消毒液浸泡時間設(shè)置為10、20、30 和40 min 4 個組，每組均設(shè)3 個平行組，按設(shè)置的消毒浸泡制備鰓細胞，取細胞懸液，在 NIKON TS100 倒置顯微鏡下觀察鰓細胞形態(tài)和染菌情況，并采用臺盼藍拒染法計數(shù)鰓細胞，用活細胞占總計數(shù)細胞的百分比表示細胞存活率。

1.3.2 胰蛋白酶消化時間的篩選 胰蛋白酶消化時間設(shè)置為15、20、25 和30 min，每個組均設(shè)3 個平行組，按設(shè)置的胰蛋白酶消化時間制備鰓細胞，取細胞懸液稀釋10 倍滴至血球計數(shù)板上，于光學(xué)顯微鏡下計數(shù)，細胞收獲量以每克鰓重分離的細胞總數(shù)表示，并計算細胞存活率，方法同上。

1.3.3 離心力的篩選 鰓組織經(jīng)消化后，離心、重懸收集鰓細胞，離心力設(shè)置為150、200 和300g，每組均設(shè)3 個平行，按設(shè)置的離心力制備鰓細胞，存活率計算方法同上，并觀察鰓細胞形態(tài)。

1.4 鰓細胞原代培養(yǎng)基的優(yōu)化

實驗以L-15 作為基本培養(yǎng)基，設(shè)置4 個胎牛血清濃度梯度5%、10%、15%和20%，每組均設(shè)3 個平行，分別培養(yǎng)6、12 和24 h，存活率計算方法同上。

1.5 B[α]P 實驗梯度設(shè)置

實驗所用B[α]P 為美國Sigma 公司生產(chǎn)，采用DMSO 作為助溶劑配制B[α]P 儲備液，將儲備液加入L-15 培養(yǎng)液中配制各染毒實驗梯度，染毒梯度設(shè)置為2、4、8 和16 μg/mL，以未加B[α]P 組為對照組，且各實驗染毒組DMSO 濃度均為0.1%。經(jīng)預(yù)實驗顯示，DMSO 處理組和對照組的鰓細胞活性無明顯差異。將制備的鰓細胞以1.2×105cells/孔接種于96 孔培養(yǎng)板中，加入含有B[α]P 的L-15 培養(yǎng)液，以6 個孔為1 個平行組，每個實驗梯度均設(shè)3 個平行，進行原代細胞培養(yǎng)，分別在6、12 和24 h 時取鰓細胞培養(yǎng)液，檢測鰓細胞活性。

1.6 鰓細胞活性的檢測方法

1.6.1 臺盼藍拒染法 參考Katsumiti 等(2018)的方法，收集培養(yǎng)的鰓細胞，調(diào)整細胞濃度為106cells/mL，取9 滴血細胞懸液，加1 滴0.4%臺盼藍染料，混勻，在3 min 內(nèi)用血球計數(shù)板分別計數(shù)活細胞和死細胞數(shù)量，計算鰓細胞相對活性(%)=實驗組細胞存活率/對照組細胞存活率×100%。

1.6.2 中性紅比色法 在B[α]P 染毒的細胞培養(yǎng)液中，加入10 μL 0.33%的中性紅溶液，黑暗處孵育1 h，棄上清液，用PBS 洗滌底部沉淀2 次，加入100 μL乙酸乙醇裂解液(乙酸1%、乙醇50%)，20℃下孵育15 min，分別在波長550 和630 nm 下用酶標儀測定吸光度值(OD 值)，并以O(shè)D550nm-OD630nm值為結(jié)果，計算鰓細胞相對活性(%)＝OD實驗組/OD對照組×100%。

1.6.3 CCK8 法 在96 孔鰓細胞培養(yǎng)板中，每孔加入10 μL CCK8 溶液，在37℃、CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，然后去細胞培養(yǎng)液，用酶標儀測定450 nm的OD值，計算鰓細胞活性(%)=(OD實驗組/OD對照組)/(OD對照組-OD空白組)×100%。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)均以3 個平行組數(shù)據(jù)的平均值±標準差(Mean±SD)表示，采用SPSS 22.0 軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan 檢驗法統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 櫛孔扇貝鰓細胞制備方法的優(yōu)化

2.1.1 消毒時間對櫛孔扇貝鰓細胞存活率的影響

由表1 可知，櫛孔扇貝鰓組織在消毒10、20 和30 min 時，原代培養(yǎng)鰓細胞存活率無明顯差異，而消毒40 min 時存活率顯著下降；經(jīng)倒置顯微鏡觀察，消毒10 和20 min 時染菌明顯，30 min 時無染菌現(xiàn)象，細胞狀態(tài)良好(圖1)。

表1 消毒時間對櫛孔扇貝鰓細胞存活率的影響Tab.1 Effects of disinfection time on the survival rate of C. farreri gill cell

圖1 櫛孔扇貝鰓組織在不同消毒浸泡時間下細胞染菌情況(40×)Fig.1 Contamination of C. farreri gill cells after disinfectant treatment for different time (40×)

2.1.2 胰蛋白酶消化時間對櫛孔扇貝鰓細胞存活率的影響 由表2 可見，胰蛋白酶消化時間對櫛孔扇貝鰓細胞收獲量影響顯著。在消化15、20 和25 min時，原代培養(yǎng)鰓細胞存活率無明顯差異，而消化30 min時，存活率顯著下降。因此，基于鰓細胞收獲量和存活率，櫛孔扇貝鰓組織胰蛋白酶的最佳消化時間為25 min。

表2 胰蛋白酶消化時間對櫛孔扇貝鰓細胞收貨量和存活率的影響Tab.2 Effects of trypsin digestion time on the amount and survival rate of C. farreri gill cell

2.1.3 相對離心力對櫛孔扇貝鰓細胞存活率的影響

表3 顯示，相對離心力對櫛孔扇貝鰓細胞存活率影響顯著。經(jīng)倒置顯微鏡觀察：離心力過大時，鰓細胞破損，內(nèi)容物釋出，細胞碎片較多(圖2)。因此，相對離心力為150g時，櫛孔扇貝原代培養(yǎng)鰓細胞存活率較高，細胞完整性好。

表3 相對離心力對櫛孔扇貝鰓細胞存活率的影響Tab.3 Effects of relative centrifugal force on the survival rate of C. farreri gill cell

圖2 不同相對離心力收集后的櫛孔扇貝鰓細胞Fig.2 The gill cells of C. farreri collected by different relative centrifugal force

2.2 櫛孔扇貝鰓細胞原代培養(yǎng)基的優(yōu)化

從表4 可以看出，添加胎牛血清對櫛孔扇貝原代培養(yǎng)鰓細胞存活率有明顯影響。6～12 h 內(nèi)，各處理組鰓細胞存活率無顯著變化；培養(yǎng)24 h 時，5%和20%胎牛血清處理組存活率明顯下降，而10%和15%處理組存活率略有下降，顯微觀察顯示，鰓細胞飽滿，活力好(圖3)。

圖3 櫛孔扇貝鰓細胞在不同濃度胎牛血清下原代培養(yǎng)24 h 的顯微觀察結(jié)果Fig.3 Gill cells of C. farreri after cultured under different FBS concentration

表4 添加胎牛血清對櫛孔扇貝鰓細胞存活率的影響Tab.4 Effects of FBS on the survival rate of C. farreri gill cell

2.3 B[α]P 對櫛孔扇貝鰓細胞活性的影響

采用臺盼藍拒染法檢測顯示，B[α]P 對櫛孔扇貝原代培養(yǎng)鰓細胞活性無顯著影響(P＞0.05) (圖4a)。由CCK8 試劑法檢測得出，B[α]P 對櫛孔扇貝鰓細胞活性僅16.0 μg/mL 處理組在12 和24 h 表現(xiàn)出顯著的抑制效應(yīng)(P＜0.05)(圖4c)。而中性紅比色法顯示，除1.0 μg/mL 處理組在6、12 h 和2.0 μg/mL 組在6 h 外，B[α]P 對櫛孔扇貝鰓細胞活性具有顯著影響(P＜0.05)，其毒性與B[α]P 染毒濃度、時間呈正相關(guān)(圖4b)。

圖4 B[α]P 對櫛孔扇貝鰓細胞活性的影響Fig.4 Effects of B[α]P on the viability of C. farreri gill cell

3 討論

越來越多的研究將貝類細胞作為體外模型用于環(huán)境監(jiān)測和生態(tài)毒理學(xué)研究，而細胞的生存能力和功能活性是體外毒性實驗的關(guān)鍵(Galganiet al, 2005)。本研究通過改進櫛孔扇貝鰓細胞的制備方法和原代培養(yǎng)條件，分離得到了具有更高活力、更多數(shù)量且不易染菌的原代細胞。

3.1 貝類組織原代細胞制備技術(shù)

貝類鰓組織作為與外界水體直接接觸的呼吸、濾食器官，鰓細胞的狀態(tài)和活力直接受海水環(huán)境的影響，因此，選擇鰓細胞作為毒性實驗材料具有一定的代表性。而鰓絲表面富含黏液，極易附著微生物群，在原代細胞培養(yǎng)取材過程中，需進行嚴格的除菌處理(Yoshinoet al, 2013)。鄧瑞鵬等(2004)將僧帽牡蠣(Saccostrea cucullata)鰓組織于消毒液(由青鏈霉素1000 U/mL 和 0.1%復(fù)方洗必泰配制而成)中浸泡50 min，鰓細胞培養(yǎng)傳至第3 代并無明顯染菌現(xiàn)象。據(jù)季愛昌等(2018)報道，櫛孔扇貝心臟組織在消毒液(青霉素100 IU/mL-鏈霉素500 μg/mL、慶大霉素100 IU/mL、制霉菌素2 μg/mL)中處理20 min，成功建立了可長期存活的原代培養(yǎng)細胞系。本研究利用青霉素100 U/mL-鏈霉素100 μg/mL 雙抗、慶大霉素80 U/mL 配制而成的消毒液，消毒浸泡30 min 時，除菌效果最佳，能夠保證鰓細胞原代培養(yǎng)活性。這說明在雙殼貝類原代細胞培養(yǎng)中，組織消毒液成分主要為抗生素，且抗生素種類、劑量和消毒時間與除菌效果密切相關(guān)。研究表明，雙殼貝類組織的消毒處理是細胞原代培養(yǎng)的關(guān)鍵，應(yīng)根據(jù)原代培養(yǎng)細胞的目的和要求，選擇適宜的消毒液和消毒時間。

與外植體法相比，酶消化法能在較短時間內(nèi)分離并獲得大量的原代細胞，且均一性好、便于觀察、細胞增殖速度較快，這對毒理學(xué)實驗至關(guān)重要(鄧瑞鵬等,2004; 艾慶輝等, 2012)。同時，酶解所獲細胞經(jīng)金屬細胞篩去除未消化完的較大細胞團和組織，一般通過離心獲得原代細胞。常用于分離脊椎動物細胞的胰蛋白酶、EDTA 劑量和酶解時間易使某些無脊椎動物細胞受損，而降低酶濃度或酶解溫度、縮短處理時間能有效減少對細胞的損傷(Yoshinoet al, 2013; 康愷等,2020)。苗晶晶(2010)將櫛孔扇貝消化盲囊置于CMFS緩沖液和胰蛋白酶分離2 h，獲得6 種不同類型的消化盲囊細胞，原代培養(yǎng) 24 h 細胞存活率＞80%。Yurdak?k-Dikmen 等(2018)采用0.125%胰蛋白酶溫育珠蚌鰓組織塊4 h，獲得活力良好的鰓細胞。Faucet等(2003)分別采用180g離心5 min、200g離心10 min收集紫貽貝(Mytilus edulis)消化盲囊、鰓原代細胞。本研究采用等體積的CMFS 和0.25%胰蛋白酶混合液，在26℃下消化櫛孔扇貝鰓組織25 min，150g離心5 min 后獲得大量分布均勻、高存活率的原代細胞。說明在雙殼貝類組織原代細胞制備過程中，酶解濃度、時間和離心力、離心時間與細胞存活率、形態(tài)、活性直接相關(guān)。

3.2 貝類組織細胞原代培養(yǎng)條件

在雙殼類的外套膜、消化盲囊、鰓和心臟等組織細胞培養(yǎng)中，多采用L-15 作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。同時，胎牛血清含有大量細胞生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，常作為動物細胞培養(yǎng)基中的添加成分。Faucet 等(2003)研究表明，紫貽貝消化盲囊細胞在L-15 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)72 h 后細胞活性可達75%以上。Le Marrec-Croq等(1999)將歐洲大扇貝(Pecten maximus)心臟細胞培養(yǎng)在L-15 海水培養(yǎng)基中，可在體外培養(yǎng)1 個月左右。據(jù)Birmelin 等(1999)報道，在紫貽貝消化盲囊細胞的L15 培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清，原代細胞培養(yǎng)存活時間長達13 d。Lang 等(2000)在培養(yǎng)櫛孔扇貝外套膜原代細胞時發(fā)現(xiàn)，M199 培養(yǎng)基中添加20%胎牛血清，細胞存活時間、活性明顯提高。季愛昌等(2018)比較了3 個胎牛血清濃度(5%、10%和20%)對櫛孔扇貝心臟原代細胞的培養(yǎng)效果。研究表明，添加5%胎牛血清時，細胞存活時間最長，且更易從組織塊中遷出。本研究表明，在L-15 培養(yǎng)基中添加10%和15%胎牛血清時，櫛孔扇貝鰓原代細胞活性最高。L-15 培養(yǎng)基僅能滿足雙殼貝類組織細胞的存活、活性等，而添加胎牛血清可明顯提高細胞生存狀態(tài)。目前，雙殼貝類組織細胞培養(yǎng)還處于探索階段，尚未達到細胞系水平。因此，關(guān)于雙殼貝類組織細胞培養(yǎng)基優(yōu)化還需進一步研究。

3.3 B[α]P 對櫛孔扇貝鰓細胞毒性效應(yīng)

由于海洋無脊椎動物尚未培養(yǎng)出永久細胞系，因此，大多數(shù)研究集中在原代培養(yǎng)細胞的應(yīng)用上，如用軟體動物細胞評估環(huán)境中污染物的毒性(Pennecet al,2001)。目前，體外細胞毒性檢測方法有很多，如臺盼藍拒染法、四甲基偶氮唑(MTT)、二甲氧唑黃(XTT)比色、CCK8 法、中性紅(NR)比色法和結(jié)晶紫比色法等，而相較于MTT 和XTT 等方法，CCK8 法沒有細胞毒性，操作便捷，且更穩(wěn)定、更靈敏(Suet al, 2017)。Domart-Coulon 等(2000)采用MTT 法檢測有機殺蟲劑Mexel-43 對長牡蠣(Crassostrea gigas)心臟細胞、蛤仔(Ruditapes decussatus)鰓細胞的活性影響。Morcillo等(2016)研究表明，相較于NR 比色法，MTT 法更適合測定重金屬對金頭鯛(Sparus aurata)成纖維細胞的毒性。本研究表明，櫛孔扇貝鰓細胞在B[α]P 脅迫濃度范圍2～16 μg/mL 時，采用NR 比色法檢測顯示，鰓細胞活性顯著下降，且下降程度與B[α]P 脅迫時間、脅迫濃度呈顯著正相關(guān)；CCK8 法檢測的鰓細胞活性僅在16 μg/mL B[α]P 處理12 h 后明顯下降；臺盼藍拒染法未檢測出B[α]P 對鰓細胞活性的影響。由此可見，不同海洋生物的組織細胞對不同種類的污染物敏感度不同，應(yīng)篩選不同的細胞活性檢測方法，這一點需引起研究者重視。

Pennec 等(2001)利用熒光素二乙酸酯(FDA)法、MTT 法、NR 方法檢測了原油(含大量PAHs)對歐洲扇貝消化盲囊原代培養(yǎng)細胞的毒性影響，認為MTT 法和NR 比色法可以反映PAHs 對細胞的毒性作用。Gòmez-Mendikute 等(2003)和劉靜等(2009)研究表明，NR 比色法可分別作為檢測貽貝(Mytillus galloprovincialis)和櫛孔扇貝血細胞在B[α]P 脅迫下毒性效應(yīng)的方法。這與本研究NR 比色法適合檢測B[α]P 脅迫下櫛孔扇貝鰓細胞活性的研究結(jié)果類似。臺盼藍拒染法、CCK8法和NR 比色法分別被用于評估膜結(jié)構(gòu)的完整性、線粒體損傷和溶酶體損傷，說明PAHs 對雙殼貝類組織細胞溶酶體損傷最為嚴重，其受損程度遠大于線粒體。研究表明，PAHs 作為一種親脂類有機污染物，能夠穿過細胞膜進入細胞，而溶酶體通過釋放代謝酶與PAHs 發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，有助于消除PAHs 對細胞的毒性作用，可能對PAHs 毒性較為敏感，適合作為PAHs 對細胞毒性實驗的檢測指標。

綜上所述，本研究優(yōu)化了櫛孔扇貝鰓細胞的制備方法，改進了培養(yǎng)基營養(yǎng)成分，為鰓原代細胞分離和培養(yǎng)提供了一種操作簡便、快速可行的方法。同時，探索B[α]P 對鰓原代培養(yǎng)細胞的毒性檢測方法，篩選出中性紅比色法可以作為評價B[α]P 對櫛孔扇貝鰓細胞毒性的檢測方法，為海洋環(huán)境PAHs 污染的細胞毒性評估提供了科學(xué)依據(jù)。