不同養(yǎng)殖密度對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦生長(zhǎng)和能量代謝的影響*

張海恩 何玉英,2① 李 健,2 韓 旭,3 謝擁軍

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東 青島 266071；2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室 山東 青島 266071；3. 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(上海海洋大學(xué)) 上海 201306；4. 河北省水產(chǎn)良種與漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測(cè)保護(hù)總站 河北 石家莊 050001)

中國(guó)明對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)為我國(guó)近海特有的品種，主要分布在黃海、渤海和朝鮮西部沿海，是我國(guó)海水養(yǎng)殖的重要種類。為了滿足人們的需求，水產(chǎn)養(yǎng)殖的不斷擴(kuò)大和過(guò)度集約化，高密度養(yǎng)殖已成為提高養(yǎng)殖產(chǎn)量、降低養(yǎng)殖成本的重要途徑。然而，高密度養(yǎng)殖增加了個(gè)體之間對(duì)資源與空間的競(jìng)爭(zhēng)，蝦在高密度養(yǎng)殖下會(huì)更頻繁地游動(dòng)，造成更多的能量消耗而影響生長(zhǎng)(Costaet al, 2016)，最終可能會(huì)導(dǎo)致對(duì)蝦生存能力降低。

神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機(jī)制是將應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的激素分泌到血液中，由血液循環(huán)系統(tǒng)帶到靶細(xì)胞上發(fā)揮作用，會(huì)引起機(jī)體發(fā)生一系列的生理生化反應(yīng)，包括主要能量物質(zhì)代謝、免疫能力、呼吸作用等。能量的儲(chǔ)存與釋放是一切生物生存最基本的活動(dòng)，所以，主要能量代謝是研究的重要部分。當(dāng)生物體處于脅迫時(shí)，糖類作為首要和迅速的能源物質(zhì)被用于供能，動(dòng)用的碳水化合物以單糖形式進(jìn)入血淋巴，導(dǎo)致血糖濃度升高(Sanchoet al, 1997)。其中，血液是發(fā)揮物質(zhì)運(yùn)輸、調(diào)節(jié)生理等功能的一項(xiàng)非常重要組織，可以反映機(jī)體的健康狀況；血糖已被認(rèn)為是動(dòng)物受到脅迫的一個(gè)靈敏指標(biāo)，而脂類、蛋白質(zhì)含量的改變也是甲殼動(dòng)物在遭遇脅迫時(shí)的一種常見(jiàn)效應(yīng)。已有研究表明，重復(fù)取樣(Racottaet al, 2007; Palacioset al,1999)、缺氧(Hallet al, 2010)及氨氮(NH4+-N)脅迫(Racotta,et al, 2000)等條件均使對(duì)蝦血液中能量物質(zhì)發(fā)生不同程度的變化。密度脅迫作為養(yǎng)殖過(guò)程中重要環(huán)境因子，會(huì)對(duì)養(yǎng)殖對(duì)蝦造成一定的生理生化影響。衣萌萌等(2012)研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖密度可改變凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量在體內(nèi)的積累過(guò)程，所以，研究主要能量物質(zhì)的代謝和利用具有重要的意義。

目前，有關(guān)中國(guó)明對(duì)蝦在密度脅迫下生長(zhǎng)與能量代謝關(guān)系的研究相對(duì)較少。本研究通過(guò)對(duì)不同養(yǎng)殖密度下，中國(guó)明對(duì)蝦生長(zhǎng)指標(biāo)、血液能量代謝產(chǎn)物含量和相關(guān)酶活力指標(biāo)的測(cè)定，探究中國(guó)明對(duì)蝦生長(zhǎng)性能及體內(nèi)能量代謝需求的類型，以期為進(jìn)一步研究中國(guó)明對(duì)蝦在不同密度脅迫下的適應(yīng)機(jī)制提供參考，并為中國(guó)明對(duì)蝦的養(yǎng)殖提供相應(yīng)的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用中國(guó)明對(duì)蝦于2018 年7 月取自山東省濰坊昌邑市海豐水產(chǎn)養(yǎng)殖有限責(zé)任公司。平均體長(zhǎng)為(7.20±0.21) cm，體重為(4.50±0.04) g，置于養(yǎng)殖公司室內(nèi)養(yǎng)殖池暫養(yǎng)7 d 后用于密度實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)采用單個(gè)規(guī)格為50 cm×50 cm×80 cm 的網(wǎng)箱進(jìn)行養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)網(wǎng)箱統(tǒng)一放置在半徑為1.5 m、高為0.8 m 的圓形水泥池中，水位保持0.6 m，消除環(huán)境因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置4 個(gè)養(yǎng)殖密度，每個(gè)網(wǎng)箱分別放養(yǎng)15、30、45 和60 尾中國(guó)明對(duì)蝦，密度分別設(shè)為100、200、300 和400 尾/m3，標(biāo)記為G1、G2、G3 和G4 組，每個(gè)養(yǎng)殖密度3 個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)周期為28 d，分別在0、1、7、14、28 d 取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3 尾對(duì)蝦。

1.3 飼養(yǎng)管理

實(shí)驗(yàn)用水為過(guò)濾凈化后的天然海水，鹽度為31.52～33.61，水溫為25℃～28℃，pH 為8.06～8.19，溶解氧(DO)為5.81～6.62 mg/L，24 h 持續(xù)充氧，每天投喂對(duì)蝦配合飼料(天馬科技公司，粒徑為1.4 mm，水分≤11.0，粗蛋白質(zhì)≥50，粗脂肪≥4.0，粗纖維≤5.0，氨基酸≥2.4，粗灰分≤17.0)，投喂量為中國(guó)明對(duì)蝦體重的6%，分3 次投喂(08:00、16:00 和22:00)。實(shí)驗(yàn)用蝦在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)用眼標(biāo)標(biāo)記，養(yǎng)殖過(guò)程中，死亡對(duì)蝦及時(shí)取出。為保持實(shí)驗(yàn)密度，從備養(yǎng)群體中選取規(guī)格一致的對(duì)蝦進(jìn)行補(bǔ)充。每天換水1/3，每3 d 檢測(cè)1 次水質(zhì)，使亞硝酸鹽等指標(biāo)保持在中國(guó)明對(duì)蝦的安全閾值內(nèi)。每7 d 測(cè)量1 次體長(zhǎng)、體重，記錄每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的死亡個(gè)數(shù)，統(tǒng)計(jì)死亡率。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 樣品的采集 按照取樣時(shí)間從各實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選取3 尾中國(guó)明對(duì)蝦，抽取血淋巴，使用1 mL 一次性注射器吸取0.5 mL 4℃預(yù)冷的抗凝劑，從對(duì)蝦的圍心腔抽取0.5 mL 的血淋巴液，將每組的3 尾對(duì)蝦的血淋巴充分混合后，加入不含RNase 的1.5 mL 離心管，以4500 r/min 離心15 min，取上清液，置–80℃冰箱保存。

1.4.2 生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定

增重率(weight gain rate,WGR,100%)=100×(W2–W1)/W1;

相對(duì)增長(zhǎng)率(relative growth rate, AGR, %/d)=100×(L2–L1)/d；

特定生長(zhǎng)率(specific growth rate, SGR, %/d)=100×(lnW2－lnW1)/d；

體重差異系數(shù)(coefficient of variability weight,CVW, 100%)=體重標(biāo)準(zhǔn)差/平均體重；

成活率(survival rate, SR, %)=100×N2/N1

式中，W1和W2分別為初始體重和末體重；L1和L2分別為初始體長(zhǎng)和末體長(zhǎng)；N1和N2分別為實(shí)驗(yàn)初始尾數(shù)和結(jié)束尾數(shù)，d為養(yǎng)殖天數(shù)。

1.4.3 能量代謝相關(guān)產(chǎn)物的測(cè)定 葡萄糖(Glc)、乳酸(LA)、丙酮酸(PA)、甘油三酯(TG)和游離氨基酸(FAA)含量，均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測(cè)定，測(cè)定方法參照所附說(shuō)明書(shū)。

1.4.4 能量代謝相關(guān)酶含量測(cè)定 琥珀酸脫氫酶(SDH)、乳酸脫氫酶(LDH)、己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)和6-磷酸果糖激酶(6-PFK)活性，均采用上海酶聯(lián)生物科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定，測(cè)定方法參照所附說(shuō)明書(shū)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 軟件單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行處理，Duncan 多重比較進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。P<0.05 為差異顯著水平，以P<0.01 為差異極顯著，使用Origin 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 養(yǎng)殖密度對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦生長(zhǎng)的影響

從表1 可以看出，中國(guó)明對(duì)蝦的SR、WGR、AGR、SGR 呈現(xiàn)隨養(yǎng)殖密度的增加而降低的趨勢(shì)。G1 組SR最高，為73.2%，與G2 組相比差異不顯著(P>0.05)；G3 和G4 組與G1 組相比差異顯著(P<0.05)和差異極顯著(P<0.01)，SR 分別下降，為47.1%和38.2%。G2 組的WGR、AGR 和SGR 均最高，與G1 組相比差異不顯著(P>0.05)；G3 和G4 組與G1 組相比，分別達(dá)顯著水平(P<0.05)和極顯著水平(P<0.01)。隨著養(yǎng)殖密度的增加，CVW 呈上升趨勢(shì)；與G1 組相比，G2 組的CVW 顯著升高(P<0.05)；G1 組與G3、G4 組相比差異極顯著(P<0.01)，說(shuō)明隨著養(yǎng)殖密度的升高，中國(guó)明對(duì)蝦生長(zhǎng)的整齊度開(kāi)始下降。

表1 密度脅迫下對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦生長(zhǎng)指標(biāo)的影響Tab.1 Effects of density stress on growth indicators of F. chinensis

2.2 養(yǎng)殖密度對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦能量代謝產(chǎn)物的影響

從圖1A～C 可以看出，除G1 組外，隨著養(yǎng)殖密度的增加，中國(guó)明對(duì)蝦體內(nèi)的Glc、LA 和PA 含量整體呈上升的趨勢(shì)，并隨著養(yǎng)殖時(shí)間的增加，3 種含量呈先上升后下降的趨勢(shì)。其中，G2 組的Glc、LA 和PA 含量變化最小，趨于穩(wěn)定，與G1 組相比差異不顯著(P>0.05)；G3 和G4 組的含量均顯著高于G1 組(P<0.05)；G4 組在養(yǎng)殖7 d 時(shí)達(dá)到最大值，與G1 組相比差異極顯著(P<0.01)。

隨著養(yǎng)殖密度的增加，中國(guó)明對(duì)蝦體內(nèi)TG 含量整體呈下降的趨勢(shì)，且隨養(yǎng)殖時(shí)間增加，TG 含量呈先下降后上升再下降的變化趨勢(shì)。其中，G2 組的TG與G1 組相比差異不顯著(P>0.05)；G3 組分別在1 和28 d 顯著低于G1 組(P<0.05)；G4 組在不同養(yǎng)殖時(shí)間均顯著低于G1 和G2 組(P<0.05)(圖1D)。不同養(yǎng)殖密度下，中國(guó)明對(duì)蝦的 FAA 含量變化差異不顯著(P>0.05)(圖1E)。

圖1 養(yǎng)殖密度對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦能量代謝產(chǎn)物的影響Fig.1 Effects of density on energy metabolism products of F. chinensis

2.3 養(yǎng)殖密度對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦代謝酶活性的影響

從圖2A、圖2C～E 可以看出，隨著養(yǎng)殖密度的增加，中國(guó)明對(duì)蝦的LDH、6-PEK、HK 和PK 的活性整體呈上升的趨勢(shì)，且隨養(yǎng)殖時(shí)間的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)。其中，G2 組的LDH、6-PEK、HK 和PK活性整體變化與G1 組相比差異不顯著(P>0.05)；G3 組的4 種酶活性均在養(yǎng)殖7 d 時(shí)開(kāi)始顯著提高(P<0.05)。6-PEK 在14 d 時(shí)達(dá)到最大值，與G1 組相比差異極顯著(P<0.01)；G4 組的4 種酶活性最高且顯著高于G1和G2 組(P<0.05)。LDH、6-PEK、HK 和PK 在14 d 時(shí)均達(dá)到最大值，與G1 組相比差異極顯著(P<0.01)。隨著養(yǎng)殖密度的增加，中國(guó)明對(duì)蝦體內(nèi)SDH 活性整體呈下降的趨勢(shì)，且隨著養(yǎng)殖時(shí)間的增加，G1 和G2 組SDH 活性呈先下降后上升的趨勢(shì)，G1 和G2 組之間相比差異不顯著(P>0.05)；G3 和G4 組SDH 活性顯著降低(P<0.05)，G4 組在28 d 時(shí)與G1 組相比差異極顯著(P<0.01)(圖2B)。

圖2 養(yǎng)殖密度對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦能量代謝酶活性的影響Fig.2 Effects of density on the activities of energy metabolism enzymes of F. chinensis

3 討論

3.1 養(yǎng)殖密度對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦生長(zhǎng)的影響

通常認(rèn)為，個(gè)體增長(zhǎng)速度可以作為一個(gè)衡量密度脅迫的指標(biāo)，不同養(yǎng)殖密度對(duì)個(gè)體生長(zhǎng)的影響不同。劉國(guó)興等(2014)對(duì)克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)研究表明，隨著養(yǎng)殖密度增加，對(duì)蝦個(gè)體體重增長(zhǎng)減少。在本研究中，G2 組對(duì)蝦的各生長(zhǎng)指標(biāo)最高，說(shuō)明養(yǎng)殖密度為200 尾/m3對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦的生長(zhǎng)影響不顯著，但隨著養(yǎng)殖密度的增加，中國(guó)明對(duì)蝦的SR、WGR、AGR 和SGR 均顯著降低，CVW 顯著提高，與劉國(guó)興等(2014)對(duì)克氏原螯蝦及Marques 等(2000)對(duì)凡納濱對(duì)蝦的研究結(jié)果相一致，表明高養(yǎng)殖密度嚴(yán)重影響對(duì)蝦的生長(zhǎng)。同時(shí)也說(shuō)明，200 尾/m3密度為本研究的臨界點(diǎn)。在對(duì)溪紅點(diǎn)鮭(Salvelinus leucomaenis) (Vijayanet al, 1988)、史氏鱘(Acipenser schrencki)(李大鵬等,2004) 和大西洋鳙鰈(Hippoglossus hippoglossus)(Bj?rnsson, 1994)等研究發(fā)現(xiàn)，在某個(gè)密度范圍內(nèi)，隨著個(gè)體的不斷增長(zhǎng)，空間的制約對(duì)生物個(gè)體的影響越大。當(dāng)密度低于某個(gè)臨界值時(shí)，個(gè)體的生長(zhǎng)指標(biāo)與密度之間呈正相關(guān)或不相關(guān)，但當(dāng)密度高于此臨界值時(shí)，個(gè)體的生長(zhǎng)指標(biāo)與密度之間呈負(fù)相關(guān)(張龍崗等, 2017)。本研究中，G2 組的生長(zhǎng)指標(biāo)最高，所以，當(dāng)中國(guó)明對(duì)蝦規(guī)格為4.5 g 時(shí)，其養(yǎng)殖密度在100～200 尾/m3為宜。

3.2 養(yǎng)殖密度對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦能量代謝的影響

能量代謝主要涉及糖酵解、三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化等途徑，外界任何刺激都需要通過(guò)動(dòng)員體內(nèi)能源物質(zhì)來(lái)滿足其對(duì)能量的額外需求，緩解環(huán)境帶來(lái)的壓力(連春盎等, 2017)。在脅迫條件下，增加糖代謝是對(duì)脅迫的常見(jiàn)反應(yīng)，同樣，機(jī)體也會(huì)通過(guò)相關(guān)代謝酶的響應(yīng)，消耗脂肪和蛋白質(zhì)來(lái)滿足其對(duì)能量的需求(韓宇田等, 2012)。

在本研究中，G1 和G2 組Glc、LA 和PA 含量變化平穩(wěn)，隨著養(yǎng)殖密度的增加，G3 和G4 組的三者含量顯著提高。在對(duì)鯪魚(yú)(Cirrhinus molitorella)的研究中，密度脅迫下，Glc 和LA 含量的變化趨勢(shì)與本研究一致(Tejpalet al, 2009)，Glc 顯著升高，這表明對(duì)能源的需求增加，必須提高可代謝物質(zhì)的利用，這可能是由于高密度引起對(duì)蝦種內(nèi)激烈爭(zhēng)斗，從而使肝糖元或肌糖元不斷分解，產(chǎn)生Glc 并被運(yùn)送至血液所致(韓宇田,2012)。LA 含量顯著升高，說(shuō)明養(yǎng)殖密度增加可能導(dǎo)致對(duì)蝦機(jī)體補(bǔ)償厭氧代謝升高。另外，機(jī)體進(jìn)行糖代謝時(shí)，Glc首先通過(guò)糖酵解水解成PA，為機(jī)體提供少量能量，引起PA 含量的升高(戴超等, 2013)。除了上述物質(zhì)，中國(guó)明對(duì)蝦體內(nèi)TG 含量也發(fā)生了變化，G3和G4 組TG 含量顯著下降，這說(shuō)明高密度養(yǎng)殖可能導(dǎo)致了對(duì)蝦機(jī)體更高的能量需求和補(bǔ)償性響應(yīng)，繼續(xù)利用脂類作為能源物質(zhì)。在硬骨魚(yú)類中，已經(jīng)報(bào)道了在密度脅迫條件下可增強(qiáng)脂類代謝，以應(yīng)對(duì)增加的能量需求(Polakofet al, 2006)。在本研究中，不同養(yǎng)殖密度組之間游離氨基酸變化不顯著，則表明蛋白質(zhì)代謝未受到顯著影響。Wu 等(2000)研究表明，在饑餓脅迫和蛻皮中，中國(guó)明對(duì)蝦優(yōu)先利用蛋白質(zhì)和脂質(zhì)滿足能源需求，所以，在不同脅迫條件下，中國(guó)明對(duì)蝦利用能量代謝物質(zhì)種類的順序不同。在密度脅迫下，中國(guó)明對(duì)蝦更傾向于利用糖類和脂類作為能源。

大多數(shù)無(wú)脊椎動(dòng)物、甲殼類動(dòng)物面臨環(huán)境脅迫等不良條件下，會(huì)切換成另一種厭氧能量代謝，即糖酵解。HK、6-PEK 和PK 是糖分解過(guò)程中的限速酶，這3 種酶的活性可以反映糖酵解水平(Greenberget al,1960)。糖酵解速率的提高，有利于三磷酸腺苷酶(ATP)的生成，提高機(jī)體抵抗脅迫的耐受能力(Raúlet al,2002)。本研究結(jié)果表明，G3 和G4 組3 種限速酶活力顯著提高，表明高密度養(yǎng)殖下，對(duì)蝦通過(guò)提高糖酵解速率，提高機(jī)體對(duì)高養(yǎng)殖密度的耐受能力，從而用于對(duì)蝦生長(zhǎng)部分的能量減少。戴超等(2013)對(duì)低溫脅迫下三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的能量變化研究中也有相似結(jié)果。LDH 是一種重要的糖酵解酶，當(dāng)機(jī)體在脅迫狀態(tài)下需要額外能量供給的時(shí)候，顯得尤為重要。本研究結(jié)果表明，G3 和G4 組顯著提高了中國(guó)明對(duì)蝦LDH 活力，說(shuō)明丙酮酸向乳酸的轉(zhuǎn)化增加，高密度養(yǎng)殖增強(qiáng)了組織的無(wú)氧代謝，與Gao 等(2018)研究結(jié)果相一致。SDH 作為參與三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，是唯一嵌入到線粒體內(nèi)膜中的酶，可在一定程度上反映有氧代謝的水平(王鏡巖等, 2002)。本研究中，SDH 活性在G3 和G4 組中顯著降低，其活性的降低表明三羧酸循環(huán)活性的下降，進(jìn)一步表明高養(yǎng)殖密度抑制了組織的有氧代謝。

4 結(jié)論

綜上研究表明，隨著養(yǎng)殖密度的增加，中國(guó)明對(duì)蝦的SR 降低，生長(zhǎng)的整齊度開(kāi)始下降，顯著影響中國(guó)明對(duì)蝦的生長(zhǎng)。在高養(yǎng)殖密度下，中國(guó)明對(duì)蝦更傾向于利用糖類和脂類作為能源，密度過(guò)高導(dǎo)致機(jī)體氧化代謝途徑發(fā)生變化，分解代謝增強(qiáng)，有氧代謝受到抑制，而無(wú)氧代謝被激活。在本研究中，200 尾/m3的生長(zhǎng)指標(biāo)最高，且能量代謝消耗小。所以，當(dāng)中國(guó)明對(duì)蝦規(guī)格為4.5 g 時(shí)，其養(yǎng)殖密度100～200 尾/m3為宜。