牙鲆頭腎巨噬細胞的分離培養與鑒定*

王宣剛 孔祥福 王欣桐 李恒順 劉金相,2 王志剛 于海洋①

(1. 中國海洋大學海洋生命學院 海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室 山東 青島 266003;2. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室 山東 青島 266237)

巨噬細胞是一類由血液中的單核細胞遷移到組織中發育而來、在生物體免疫反應中具有重要意義的白細胞，它不僅在清除、呈遞抗原中發揮重要作用，還能通過釋放大量免疫因子參與宿主防御和炎癥反應(Fujiwaraet al, 2005; Johnston, 1988)。近年來，研究人員發現多種病原菌能誘導巨噬細胞發生依賴于caspase-1的程序性死亡——細胞焦亡，以自我裂解的方式釋放入侵到細胞中的病原體，使其被免疫細胞或因子清除(Broz, 2015; Jorgensenet al, 2015)。頭腎是魚類所特有的、由網狀內皮系統和淋巴組織構成的重要免疫器官(藍軍南等, 2020)，在使用鞭毛蛋白、LPS、poly I:C 對頭腎細胞進行刺激后，頭腎中與炎癥相關的細胞因子如IL-1β、IL-10和TNF-α等均出現顯著上調 (Chettriet al, 2011)。頭腎中含有包括單核巨噬細胞、淋巴細胞等在內的眾多白細胞，且獲得方便、后續操作簡便，是分離巨噬細胞的理想材料。

牙鲆(Paralichthys olivaceus)是我國重要的海水增養殖魚類，近年來，牙鲆高密度集約化的養殖方式加速了細菌、病毒等病原體的傳播速度，使得病害頻發，嚴重限制了牙鲆養殖業的發展。對牙鲆的免疫系統及免疫反應機制進行細致深入的研究，可以針對不同病原體研制出相應的有效對策，從而對疾病進行預防與控制，減少養殖中的經濟損失。熒光定量PCR及轉錄組數據分析結果顯示，牙鲆感染遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)前后腎臟中CD40基因表達量顯著上調(Liuet al, 2017)，而CD40是廣泛表達在巨噬細胞中的基因(Machet al, 1997)，提示巨噬細胞在牙鲆抵抗遲緩愛德華氏菌中可能發揮一定作用。巨噬細胞作為牙鲆先天性免疫的重要組成成分，在免疫學中一直是研究的熱點，但巨噬細胞不能繁殖(Boltonet al, 2004)，常用原代巨噬細胞進行實驗，因此，建立其分離鑒定技術對于研究牙鲆先天性免疫具有重要意義。

近年來，魚類巨噬細胞分離技術已趨于成熟，各組織巨噬細胞的分離方法相繼建立，分別從魚類的頭腎、脾臟、外周血、腸和腹腔中成功分離得到了巨噬細胞(Ganassinet al, 1998; Olivieret al, 1986; S?rensenet al, 1997; Shaet al, 2017; 陶會竹等, 2018)。從半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)的外周血中通過密度梯度離心獲得單核細胞并培養至巨噬細胞，并對細胞的吞噬能力和部分基因的表達量進行了檢測(Shaet al,2017)。陶會竹等(2018)從草魚(Ctenopharyngodon idellus)的腸中分離得到了巨噬細胞，電鏡及吉姆薩染色顯示其具備巨噬細胞形態結構特征，并具備吞噬功能。但總體而言，關于海水硬骨魚類，特別是鲆鰈類的巨噬細胞分離和鑒定的報道還比較匱乏。本研究使用牙鲆頭腎為材料，分離巨噬細胞，并摸索細胞培養條件，確定適于牙鲆巨噬細胞生長的培養基成分，并使用巨噬細胞特異性標記分子mpeg1基因對細胞類型進行鑒定(Ellettet al, 2011)，旨在為開展牙鲆巨噬細胞相關研究提供材料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所用1 齡牙鲆(體重為550～1100 g)購自山東青島南山市場，購回后所有牙鲆均養殖于18℃～20℃的海水中，每天飼喂商業飼料至實驗使用。

牙鲆鰓細胞系(FG9307)和卵巢細胞系從中國海洋大學細胞工程實驗室獲得；淋巴細胞為使用外周血淋巴細胞分離液(北京索萊寶科技有限公司)按照說明書步驟從牙鲆外周血中分離得到。

青-鏈霉素與L-15 培養基購自美國Gibco 公司；吉姆薩染液、TRIzol 購自北京索萊寶科技有限公司，反轉錄試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；膠回收試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；PCR試劑、p-EASY 連接體系及DH5α 感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司；單核細胞分離試劑盒購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司。

1.2 牙鲆頭腎巨噬細胞的分離與培養

實驗前，將牙鲆用MS-222 麻醉，將其轉移到實驗臺上，用酒精擦拭魚身進行消毒，隨后用高溫滅菌的手術剪從牙鲆的泄殖孔將其腹腔剪開，小心取出頭腎，并將其立即放入含有3%雙抗的PBS 緩沖液中。在超凈臺中用含1%雙抗的PBS 將頭腎反復沖洗5 遍以上，洗去頭腎表面的血污及可能沾染的細菌。洗凈的頭腎用眼科剪無菌操作剪成1 mm3的小塊，為防止此過程造成的組織干燥而影響下一步細胞的分離，可在剪的過程中添加少許PBS 緩沖液浸潤組織。將剪碎的組織塊轉移到70 μm 的細胞篩上，一邊輕輕按壓組織塊，一邊少量多次地添加PBS，直至所有組織塊都從篩網漏下，得到頭腎的單細胞懸液。將單細胞懸液轉移至15 mL 離心管中，20℃ 500g離心10 min，棄上清液。采用單核細胞分離試劑盒中附帶的樣本稀釋液將離心后得到的細胞沉淀重懸，取一支干凈的離心管，按3∶1 的比例分別加入試劑盒中的分離液1和分離液2，加樣過程要避免破壞分層。在最上層加入重懸后的細胞懸液(與分離液1、2 體積之和的比為1∶2)，隨后在20℃ 500 g 條件下離心30 min。離心后吸取富含巨噬細胞的上層灰白色細胞層至新離心管，加入PBS 緩沖液輕輕吹打對細胞進行清洗，隨后20℃ 200 g 離心10 min，棄上清液。使用PBS 重復對細胞清洗1 次。

分別使用DMEM/F12 (1∶1)、RPMI1640、L-15(Gibco)培養基和其他公司生產的L-15 培養基及1%、5%、10%濃度的胎牛血清配制成不同組分的培養基，各組均加入1%青-鏈霉素、1%非必需氨基酸、30%L929 細胞培養基，摸索適合牙鲆巨噬細胞生長的培養基及血清條件。得到的細胞沉淀用相應培養基重懸，將細胞密度調至5×106個/mL，使用臺盼藍統計細胞存活率。將調整密度后的細胞轉移到6 孔細胞培養板中，24℃下培養4 h 后洗去未貼壁的細胞，即得到純度較高的巨噬細胞。在光學顯微鏡及倒置顯微鏡下對細胞拍照，比較不同類型培養基及血清濃度對牙鲆巨噬細胞生長的影響。細胞在24℃不含CO2的培養箱中繼續用生長培養基培養，直至取用。

1.3 牙鲆頭腎巨噬細胞的吉姆薩染色

使用細胞刮小心刮取培養在6 孔板中的牙鲆巨噬細胞，用PBS 緩沖液清洗1 遍，200 g 離心10 min后棄上清液，加入PBS 緩沖液重懸，吸取部分細胞懸液制成血涂片，自然風干后滴加吉姆薩染液染色15 min，隨后洗去染液，顯微鏡下觀察染色結果。

1.4 細胞RNA 的提取和cDNA 的合成

使用TRIzol 對牙鲆巨噬細胞消化后按照說明書提取細胞中的RNA，使用gDNA Eraser 試劑盒對RNA反轉錄及合成cDNA。

1.5 牙鲆巨噬細胞中mpeg1 基因的擴增與鑒定

利用實驗室已有的牙鲆基因組，通過本地blast獲得牙鲆mpeg1基因序列，在IDT 網站(https://sg.idtdna.com/pages)在線設計該基因的特異性引物，擴增其ORF 區段，引物序列：mpeg1-Fw(5'-GTCATGAA GACAGCAGTG-3'；mpeg1-Rv(5'-CTTGTGTCTGGGA CAAAC-3')，以上一步得到的cDNA 為模板，使用北京全式金生物的TransStart?FastPfu DNA Polymerase進行PCR 擴增，PCR 體系：5×TransStart?FastPfu buffer 5 μL，dNTP (10 mmol/L) 2 μL，模板1 μL，正、反向引物各0.5 μL，TransStart?FastPfu DNA polymerase 0.5 μL，ddH2O 15.5 μL，共25 μL。反應程序：95℃2 min；95℃ 20 s，52℃ 20 s，72℃ 45 s，40 個循環；72℃ 10 min，4℃保存。反應結束后，使用2%瓊脂糖凝膠電泳對產物進行檢測，切膠回收后與pEASY?-Blunt Simple 載體連接，轉入DH5α 感受態細胞后培養，選取陽性克隆菌株送華大基因測序。

2 結果

2.1 牙鲆頭腎巨噬細胞的分離與培養

將分離得到的牙鲆巨噬細胞經在6 孔細胞培養板中培養4 h，洗去未貼壁的細胞，顯微鏡鏡檢發現(圖1)，多數細胞呈貼壁狀態，細胞多呈卵圓形、橢圓形等。臺盼藍染色顯示細胞存活率為99.62%。培養7 d 后，大多數細胞仍保持貼壁狀態，狀態良好。

圖1 倒置顯微鏡觀察到的牙鲆頭腎巨噬細胞Fig.1 Photomicrograph of macrophages derived from head kidney of Japanese flounder

2.2 牙鲆巨噬細胞培養條件的優化

為了確定適合體外培養牙鲆巨噬細胞的條件，使用不同培養基及不同濃度的血清對細胞進行培養，并統計了細胞在不同條件下培養的貼壁比率。在培養基選擇上，比較了DMEM/F12 (1∶1)培養基、RPMI1640培養基、L-15(Gibco)培養基以及其他公司生產的L-15培養基；在血清濃度選擇上，向相同的培養基中分別添加了1%、5%和10%的胎牛血清，以摸索合適的血清濃度。不同類型培養基及不同濃度血清培養的細胞均培養在24℃不含CO2的培養箱中。在使用不同條件培養細胞24 h 后，利用血球計數板統計每孔中貼壁細胞的數量，以探究不同條件對細胞貼壁程度的影響。胎牛血清濃度為5%時不同類型培養基對牙鲆巨噬細胞貼壁的影響見圖2。為了使結果更為直觀，定義貼壁最多組細胞的貼壁率為100%，用每組貼壁細胞的數量比貼壁最多組細胞的數量得到其余各組的貼壁率，通過折線圖反映不同培養基及不同濃度血清對牙鲆巨噬細胞培養的影響(圖3)。結果顯示，L-15(Gibco)培養基比較適合用來培養牙鲆巨噬細胞，該條件下細胞貼壁數量較多。此外，與其他2 個濃度組相比，含5%血清的培養基中細胞生長狀態最好，而含1%和10%血清的培養基中細胞貼壁數量較少。

圖2 使用不同類型培養基對牙鲆巨噬細胞培養的顯微鏡觀察結果Fig.2 Photomicrograph of macrophages of Japanese flounder cultured with different types of medium

圖3 使用不同類型培養基及不同濃度血清對牙鲆巨噬細胞培養24 h 后細胞的貼壁率Fig.3 Adhesion rate of macrophages of Japanese flounder cultured with different types of media and different concentrations of serum for 24 h

此外，貼壁效果較好的L-15 (Gibco)培養基培養細胞7 d 后的貼壁比率結果顯示(圖4)，細胞狀態較為平穩，直至培養7 d 時，貼壁率仍保持在80%以上。

圖4 使用L-15(Gibco)培養基培養的牙鲆巨噬細胞在不同時間點的貼壁率Fig.4 Adhesion rate of macrophages of Japanese flounder cultured with L-15(Gibco) media at different time points

2.3 牙鲆巨噬細胞的吉姆薩染色

如圖5 所示，經吉姆薩染色后觀察發現，分離得到的細胞體積較大，呈圓形或橢圓形，細胞核被染成紫紅色，較大且偏向一側，與報道中草魚(陶會竹等,2018)、半滑舌鰨(Shaet al, 2017)巨噬細胞形態結構一致，符合巨噬細胞特征。

圖5 牙鲆巨噬細胞的吉姆薩染色結果Fig.5 Macrophages of Japanese flounder stained by Giemsa

2.4 牙鲆巨噬細胞中mpeg1 基因的擴增

以牙鲆巨噬細胞cDNA 為模板，對mpeg1基因進行PCR 擴增，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果，并以牙鲆淋巴細胞、鰓細胞和卵巢細胞為陰性對照，使用各模板擴增了牙鲆的β-actin基因。如圖6 所示，4 種模板均擴增出β-actin條帶，而只有牙鲆巨噬細胞中擴增出與mpeg1的ORF 區段大小接近的條帶，該條帶的測序結果顯示，此序列包含的ORF 序列與牙鲆mpeg1基因ORF 區相似度達99.86%，僅有3 個堿基發生突變，可認為分離得到的細胞中表達mpeg1基因。

圖6 牙鲆巨噬細胞中mpeg1 基因的擴增結果Fig.6 Amplification of mpeg1 in macrophages of Japanese flounder

3 討論

巨噬細胞在以先天性免疫為主的硬骨魚中發揮重要作用，具有呈遞抗原、殺滅和清除入侵病原體的功能，建立完備的巨噬細胞分離培養鑒定技術對于研究巨噬細胞的特性及其在免疫應答中的作用具有重要意義。頭腎作為魚類重要的免疫器官，富含巨噬細胞、淋巴細胞等多種免疫細胞，是分離巨噬細胞的良好材料。近年來，關于從硬骨魚頭腎中分離巨噬細胞的研究較多，Teles 等(2011)從虹鱒(Oncorhynchus mykiss)的頭腎中獲得了巨噬細胞，但單細胞懸液中紅細胞的數量遠高于巨噬細胞，不經離心分選便進行貼壁培養使獲得的巨噬細胞數量較少，難以滿足實驗的需求；Li 等(2013)通過Percoll 法從大黃魚(Larmichthys crocea)的頭腎中分離到巨噬細胞，使用L-15 培養基培養，并利用差速貼壁法純化細胞。此外，還有研究人員從紅鯉(Cyprinus flammans) (Yanget al, 2015)、大西洋鱈魚(Gadus morhua) (S?rensenet al, 1997)和鯉魚(Cyprinus carpio) (Joerinket al, 2006)的頭腎中分離出巨噬細胞。

本研究采用機械法獲取了牙鲆頭腎的單細胞懸液。常用的方法還有使用胰蛋白酶、膠原蛋白酶對組織進行解離的酶消化法，該方法對酶的濃度和消化時間要求較為嚴格，酶的濃度不夠、消化時間過短容易造成組織無法消化成單個細胞，后續得到的細胞少，而酶濃度過高、消化時間過長則會對細胞造成傷害。對于不同物種的不同組織需要一系列的實驗摸索才能確定合適的消化條件；而機械法是將剪碎的組織塊輕輕按壓，使其通過細胞濾網從而獲得單細胞懸液，避免了因酶濃度不適宜而引起后續結果不理想的弊端，更為穩定簡單。隨后通過離心獲得與巨噬細胞大小接近的細胞層，但這些細胞中仍含有少數淋巴細胞和紅細胞。與哺乳動物不同，魚類作為低等脊椎動物，成熟的紅細胞中也含有細胞核，而紅細胞裂解液是根據成熟紅細胞無細胞核來對其進行裂解的，因此，無法使用紅細胞裂解液來清除魚類紅細胞。根據Li 等(2013)的方法，利用巨噬細胞在短時間內貼壁而其他細胞不能貼壁的特性，在培養4 h 后，將未貼壁的細胞洗去，通過差速貼壁法分離，對得到的巨噬細胞進行一定程度的純化。

本研究中，嘗試使用不同方法培養細胞，并比較細胞生長狀態以確定適于培養牙鲆巨噬細胞的培養基成分。統計結果顯示，相較于其他類型的培養基，L-15(Gibco)培養基更適于牙鲆巨噬細胞的體外培養，主要表現為細胞貼壁率較高，且隨著培養時間的延長，細胞狀態保持良好。王秋華等(2011)在其他硬骨魚中也使用L-15 培養基，考慮可能L-15 培養基中的成分更能滿足硬骨魚巨噬細胞生存的需求。關于羅非魚(Oreochroms mossambcus)巨噬細胞培養的研究顯示，使用10%胎牛血清培養的細胞僅少數貼壁，5%胎牛血清和5%魚血清組的細胞部分貼壁，10%魚血清組的細胞大部分貼壁，表明不同血清對羅非魚巨噬細胞的體外培養有較大影響，魚血清更有利于其巨噬細胞的體外培養(王秋華等, 2011)。本研究結果顯示，僅添加胎牛血清便足以維持牙鲆巨噬細胞的體外正常生長，且5%濃度的血清比1%和10%濃度更適于細胞培養。Hume 等(2012)研究表明，巨噬細胞集落因子CSF-1 對促進單核細胞增殖分化及維持巨噬細胞存活具有重要作用，而小鼠成纖維細胞L929 在生長的過程中可向培養基中分泌巨噬細胞集落因子。因此，本研究添加L929 細胞的培養基來培養巨噬細胞以維持其正常狀態。

此外，本研究從細胞形態及巨噬細胞特異性標記兩方面對牙鲆巨噬細胞進行鑒定。吉姆薩染色顯示，與半滑舌鰨及草魚的巨噬細胞類似(Shaet al, 2017;陶會竹等, 2018)，本研究分離得到的細胞呈圓形或橢圓形，細胞核染色較深，呈卵圓形或腎形，偏向細胞一側，符合巨噬細胞形態特征；對于基因標記，常使用流式細胞儀來識別哺乳動物的特異性標記，從而鑒定細胞類型，但在硬骨魚中較難實現。本研究選取mpeg1基因這一巨噬細胞特異性分子標記對細胞類型進行鑒定，在牙鲆巨噬細胞中成功擴增出該基因，且在陰性對照組中無法擴增，進一步證明本研究分離得到的細胞為巨噬細胞(Ellettet al, 2011)。

本研究建立了一種分離鑒定牙鲆巨噬細胞的方法，篩選得到了適合培養牙鲆巨噬細胞的條件，為下一步體外研究牙鲆免疫反應提供了良好的實驗材料，為后續開展牙鲆免疫應答相關實驗奠定了基礎。