草魚生長相關(guān)優(yōu)勢基因型的聚合效果分析*

孫 雪 李勝杰 杜金星 姜 鵬 周家輝 白俊杰

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點實驗室廣東 廣州 510380；2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306)

多基因聚合育種是通過不同基因型的個體雜交將有利基因聚合到同一個基因組中，從而獲得優(yōu)良品種的育種方法(Servinet al, 2004)。多基因聚合育種技術(shù)在農(nóng)作物和畜禽中已廣泛被應(yīng)用。利用分子標(biāo)記輔助選擇與傳統(tǒng)選育相結(jié)合的方法，將小麥的高蛋白基因GPC-B1和抗白粉病基因Pm21、1Dx5和1Dy10等進行聚合，獲得兼具高蛋白質(zhì)含量和高抗病力性狀的小麥品系(胡云等, 2016)。在優(yōu)質(zhì)肉雞多基因聚合研究中，將4 個與繁殖性能相關(guān)的基因(NPY、NCOA-1、IGF-1和GDF-9)進行聚合，獲得在開產(chǎn)日齡、開產(chǎn)體重及300 日齡合格種蛋率最優(yōu)的優(yōu)勢基因聚合個體，其繁殖性狀顯著優(yōu)于上一世代親本(王錢保等,2018)。中國美利奴羊(Ovis arios)(曾獻存等, 2011)和蘇姜豬(Sus scrofa)(王宵燕等, 2007)多基因聚合研究結(jié)果顯示，與生長性狀關(guān)聯(lián)的優(yōu)勢基因型聚合數(shù)量越多，生長性狀表型越優(yōu)秀。目前，在水產(chǎn)動物中有關(guān)基因聚合研究的報道較少，孫效文等(2009)對德國鏡鯉(Cyprinus carpio)群體中最大個體及最小個體所富集的優(yōu)勢基因型情況進行分析，發(fā)現(xiàn)最大個體中優(yōu)勢基因型數(shù)量為1.7 個，最小個體中優(yōu)勢基因型數(shù)量為0.7 個，反映了與生長性狀相關(guān)優(yōu)勢基因型的聚合數(shù)量多少與鏡鯉生長速度緊密相關(guān)。李勝杰等(2019)分析了大口黑鱸(Micropterus salmoides)家系中生長性狀相關(guān)優(yōu)勢基因聚合效果，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢基因聚合數(shù)量多少與生長性狀顯著呈正相關(guān)。

草魚(Ctenopharyngodon idella)是我國淡水養(yǎng)殖魚類中年產(chǎn)量最高的養(yǎng)殖品種。目前，在草魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中尚未有經(jīng)過人工選育、通過國家審定的優(yōu)良養(yǎng)殖品種。近年來，多數(shù)草魚繁殖場對繁殖使用親本的操作不規(guī)范，通常選擇親緣關(guān)系近、體型小、性成熟早的個體進行苗種生產(chǎn)，導(dǎo)致養(yǎng)殖草魚出現(xiàn)一定程度的種質(zhì)退化現(xiàn)象，制約草魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展(Jiang,2009; Yuet al, 2014; 田園園等, 2019)。由于草魚的性成熟年齡普遍為4～5 齡，選育周期長，在草魚良種選育研究中，有必要探索利用分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)來加快草魚良種選育進度。本實驗室前期利用候選基因關(guān)聯(lián)分析方法在草魚載脂蛋白A-I-1 基因(apoA-I-1)(劉小獻等, 2012)、丙酮酸激酶1 型(PKL)(唐小紅,2015)、羧肽酶A1 (CPA1)(曹婷婷等, 2012b)、檸檬酸合酶(CS)(樊佳佳等, 2014)、醛縮酶B (Aldo-B)(曹婷婷等, 2012a)、生長催乳素α (SLα)和肌球蛋白重鏈(MYH)基因上篩選到10 個與生長性狀關(guān)聯(lián)SNP 標(biāo)記，本研究在此基礎(chǔ)上通過對親本的基因型進行分析并構(gòu)建優(yōu)勢基因型聚合家系，進一步分析生長相關(guān)優(yōu)勢基因型的聚合數(shù)量與生長性狀的相關(guān)性，以期為草魚分子標(biāo)記輔助育種提供基礎(chǔ)資料和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 草魚親本的挑選與養(yǎng)殖

實驗魚來自江蘇省蘇州市未來水產(chǎn)養(yǎng)殖場，從中挑選48 尾親魚，其中，雌魚和雄魚各24 尾，放于同一池塘養(yǎng)殖。將每尾親魚注射電子芯片標(biāo)記，同時，剪取腹鰭樣本并放入無水乙醇中保存，用于提取DNA 和基因型分析。

1.2 生長性狀相關(guān)分子標(biāo)記的選擇

本實驗室前期所獲得的10 個與生長性狀相關(guān)的SNP 標(biāo)記(G851A、T+744C、A+762G、C+36A、C-499G、A117C、C+1042A、U8014、U2903 和U11628)分別位于apoA-I-1、PKL、CPA1、CS、Aldo-B、SLα、MYH基因上，經(jīng)關(guān)聯(lián)分析表明，其與生長性狀顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)相關(guān)。各個標(biāo)記在進行PCR 反應(yīng)中所用的引物序列見表1。所有引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 所用草魚生長性狀相關(guān)分子標(biāo)記的相關(guān)信息Tab.1 Primers of growth-associated markers of grass crap

1.3 基因組DNA 的提取

使用TIANGEN 海洋動物組織基因組提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取草魚親本和子代群體鰭條樣品的基因組DNA，使用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳和酶標(biāo)儀檢測DNA 質(zhì)量和濃度，DNA 保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 生長相關(guān)標(biāo)記的基因型檢測

SNP 標(biāo)記采用SNaPshot 分型方法，分析其在每尾草魚中的基因型，委托上海捷瑞生物工程有限公司完成。實驗流程：首先根據(jù)SNP 標(biāo)記上下游的序列設(shè)計引物，長度為200～500 bp，用于含有SNP 目的片段的擴增，采用多重PCR 方法對模板進行擴增，反應(yīng)程序采用Touch-down 方法，95℃預(yù)變性3 min；94℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s，11 個循環(huán)，每個循環(huán)的退火溫度降0.5℃；然后，進入下一個循環(huán)程序，94℃變性15 s，54℃退火15 s，72℃延伸30 s，24 個循環(huán)；最后，72℃延伸3 min。將擴增到的目的片段用ExoⅠ和FastAP 進行純化，去除反應(yīng)產(chǎn)物中的剩余引物和dNTP。使用SNaPshot 試劑盒(ABI 公司, 美國)中的SNaPshot Mix 試劑與純化后的PCR 產(chǎn)物混合，對PCR 產(chǎn)物進行延伸反應(yīng)，延伸引物的設(shè)計是在SNP 標(biāo)記的上游或是反向的下游位置，延伸產(chǎn)物溫度變性后在ABI3730 全自動測序儀上進行測序。

1.5 家系的構(gòu)建及子代培育

分析各個與生長性狀相關(guān)的標(biāo)記在24 尾雌魚和24 尾雄魚親本中的基因型分布情況，依據(jù)家系兩親本中至少有一個雜合子且子代中存在優(yōu)勢基因型的原則，選擇可聚合出優(yōu)勢基因型最多的1 對親本進行繁殖并構(gòu)建全同胞家系。在繁殖過程中，采用人工注射催產(chǎn)劑的方法促進產(chǎn)卵，收取的受精卵置于環(huán)道孵化池內(nèi)孵化。將孵出的家系魚苗放入面積為3333 m2的池塘養(yǎng)殖。7 月齡時，從家系子代中采集382 尾實驗魚進行體質(zhì)量、全長、體高、頭長、尾柄高和尾柄長的測量，同時，剪取腹鰭樣本并放入無水乙醇中保存，用于提取DNA 和基因型分析。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

先對家系子代個體中的10 個生長標(biāo)記進行基因分型，再進行優(yōu)勢基因型的統(tǒng)計分析。根據(jù)所含優(yōu)勢基因型數(shù)量不同進行分組，采用SPSS 19.0 軟件的一般線性模型(general linear model, GLM)，對不同優(yōu)勢基因數(shù)量的組別與生長性狀之間相關(guān)性進行最小二乘分析。統(tǒng)計分析模型采用如下公式：

式中，Yij為某個性狀第i個標(biāo)記第j個個體觀測值；u為實驗觀測所有個體的平均值(總體平均值)；Bi為第i個標(biāo)記的效應(yīng)值；eij為對應(yīng)于觀察值的隨機殘差效應(yīng)(徐磊等, 2014)。

2 結(jié)果與分析

2.1 草魚親本基因型分析

分析48 尾草魚親本的基因型，從中篩選出能夠在子代中聚合出優(yōu)勢基因型數(shù)量最多(7 個)的1 對父母本個體配對繁殖及構(gòu)建家系，親本基因型結(jié)果見表2。在家系子代中，G851A 標(biāo)記的基因型均為純合子，C+36A 和U11628 標(biāo)記都不存在優(yōu)勢基因型，在下面的優(yōu)勢基因型數(shù)量統(tǒng)計中不分析這個3 個標(biāo)記，僅統(tǒng)計其余7 個標(biāo)記。部分標(biāo)記的基因型檢測結(jié)果見圖1。

表2 10 個生長標(biāo)記在草魚家系親本中的基因型Tab.2 Genotype of 14 growth related markers in grass crap parents

圖1 A+762G 標(biāo)記基因型檢測圖Fig.1 A+762G marker genotype detection map

2.2 草魚子代基因型分析

對T+744C、A+762G、C-499G、A117C、C+1042A、U8014 和U2903 標(biāo)記在草魚家系子代中的優(yōu)勢基因型進行統(tǒng)計分析，每個標(biāo)記的優(yōu)勢基因型分布頻率見表3。結(jié)果顯示，C+1042A 標(biāo)記的優(yōu)勢基因型分布頻率最高，在子代中所占比例為51.31%；U8014 標(biāo)記在子代中的優(yōu)勢基因型頻率最低，所占比例為24.35%。不同子代個體中含有的優(yōu)勢基因型數(shù)量范圍為0～7 個，其中，具有聚合優(yōu)勢基因型數(shù)量7 個的個體數(shù)量是6 尾，而不含優(yōu)勢基因型數(shù)量的個體數(shù)量為44 尾。所占比例最多的為具有3 個優(yōu)勢基因型的個體，占子代總數(shù)的21.99%。全部子代個體中平均優(yōu)勢基因型的數(shù)量為2.58，相比親本群體的優(yōu)勢基因型平均數(shù)量(1.00)得到顯著提高(P＜0.05)。

表3 不同標(biāo)記中優(yōu)勢基因型的分布頻率Tab.3 The frequency of dominant genotypes of different markers

2.3 草魚生長性狀相關(guān)的優(yōu)勢基因聚合效果分析

對草魚子代中含有的優(yōu)勢基因數(shù)量及其生長性狀進行分析。結(jié)果顯示，具有7 個優(yōu)勢基因型組的生長性狀最佳，體質(zhì)量平均值為176.67 g，比不含優(yōu)勢基因型組的平均體質(zhì)量高36.26%。不含優(yōu)勢基因型的個體的體質(zhì)量、體長、體高、頭長、尾柄長和尾柄高等5 個生長性狀平均值均低于其他具有多個優(yōu)勢基因型的個體，且7 個、6 個、5 個、4 個、3 個和2 個優(yōu)勢基因型組均分別與1 個和0 個優(yōu)勢基因型組的平均體質(zhì)量差異顯著(P＜0.05)。7 個優(yōu)勢基因型組與5 個、4 個、3 個和2 個優(yōu)勢基因型組的平均體質(zhì)量差異顯著(P＜0.05)，6 個優(yōu)勢基因型組與3 個和2 個優(yōu)勢基因型組的平均體質(zhì)量差異顯著(P＜0.05)。

表4 家系子代中所含不同優(yōu)勢基因型數(shù)量的個體的生長數(shù)據(jù)比較(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)Tab.4 Analysis of growth traits of grass carp with different number of pyramiding dominant genotypes (Mean±SD)

3 討論

傳統(tǒng)選育方法主要通過對表型性狀選擇來進行選育改良，選擇效果易受環(huán)境等因素影響。分子標(biāo)記選擇可克服傳統(tǒng)育種技術(shù)的一些不足，提高育種效率和選擇強度(劉福平等, 2008)。分子標(biāo)記分為連鎖標(biāo)記和功能標(biāo)記，應(yīng)用連鎖標(biāo)記經(jīng)常達不到育種目的，且連鎖標(biāo)記可能受遺傳背景的限制，無法應(yīng)用于非多態(tài)群體(孫立亭等, 2019; Fujiiet al, 2000)。功能標(biāo)記是指從影響性狀變異基因的功能域開發(fā)出來的多態(tài)性標(biāo)記，利用功能性標(biāo)記開展分子標(biāo)記輔助選擇，對基因本身進行選擇，從而保證了選擇的準(zhǔn)確性和高效性(李揚等, 2016; 陳華增等, 2010; 顧冰寧等, 2018)。本研究基于實驗室前期利用候選功能基因關(guān)聯(lián)分析研究獲得的與草魚生長性狀相關(guān)10 個SNP 標(biāo)記作為研究對象，選擇可聚合出優(yōu)勢基因型最多的1 對親本構(gòu)建家系。結(jié)果顯示，子代個體的優(yōu)勢基因型的平均數(shù)量為2.58，顯著高于親本群體的平均優(yōu)勢基因型數(shù)量(1.00)，說明通過目的性挑選親魚進行基因聚合育種研究，能夠提高選擇群體中優(yōu)勢基因型的數(shù)量，為后續(xù)利用分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)開展草魚良種選育提供了科學(xué)依據(jù)。

生長是決定魚類經(jīng)濟價值最重要的性狀之一，受眾多功能基因調(diào)控(李勝杰等, 2018)。如果僅僅從單基因入手進行分子輔助育種，往往不能達到全面提高生長性狀的目的。多基因聚合技術(shù)可實現(xiàn)多個優(yōu)勢基因的有利整合，達到培育出生長性狀優(yōu)良的草魚品系(傅建軍等, 2016)。宋易等(2016)在翹嘴鱖(Siniperca chuatsi)“華康1 號”5 代選育中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1～F5所含優(yōu)勢基因型平均數(shù)量依次增加，且生長速率也隨之增加。徐磊等(2014)分析大口黑鱸優(yōu)勢基因型聚合效果發(fā)現(xiàn)，子代個體中含優(yōu)勢基因型數(shù)量與生長性狀顯著相關(guān)，且含6 個優(yōu)勢基因型的個體平均體質(zhì)量比含1 個優(yōu)勢基因型的個體提高34.14%。李紅霞等(2014)在建鯉(Cyprinus carpiovar.Jian)優(yōu)勢基因聚合中發(fā)現(xiàn)，子代含4 個優(yōu)勢基因型的個體平均增重比不含優(yōu)勢基因型的個體快14%。本研究子代個體所含優(yōu)勢基因型數(shù)量與生長性狀的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，優(yōu)勢基因型聚合數(shù)量與草魚生長性狀呈正相關(guān)，與鱖魚(宋易等,2016)、大口黑鱸(李勝杰等, 2019)、鯉(孫效文等, 2009)的研究結(jié)果一致。含7 個優(yōu)勢基因型個體的平均體質(zhì)量比不含優(yōu)勢基因型的個體提高36.26%。可見，利用多基因聚合技術(shù)將草魚生長相關(guān)的基因聚合，可實現(xiàn)生長表型性狀的大幅度改良。這也表明，在今后的草魚良種選育過程中，利用分子標(biāo)記技術(shù)直接選擇可聚合草魚生長優(yōu)勢基因數(shù)量多的個體作為親本進行繁育，可取得良好的遺傳改良效果。

多基因聚合過程中，每增加一個基因的篩選，將會有一部分材料遭到淘汰，可供挑選的目標(biāo)個體數(shù)也將大大降低(徐磊等, 2014)。本研究也反映出這種現(xiàn)象，從子代個體所含的優(yōu)勢基因型的數(shù)量分布結(jié)果來看，含2 個和3 個優(yōu)勢基因型個體數(shù)最多，所占比例分別為21.73%和22.25%；含7 個優(yōu)勢基因型的個體數(shù)最少，所占比例為1.57%，可供選擇的數(shù)量相對較少。孫立亭等(2019)對水稻稻瘟病抗性進行多基因聚合效果分析時發(fā)現(xiàn)，隨著含抗病基因數(shù)的增加，對應(yīng)的材料數(shù)量明顯降低。這可能是由于個體在含2～3 個優(yōu)勢基因型時，其基因型的組成方式存在多樣化，隨著子代含有優(yōu)勢基因型數(shù)目的增加，基因型之間的組合方式隨之減少。后續(xù)可通過擴大研究群體或者增加聚合基因的數(shù)量來解決這一問題，從而獲得較多數(shù)量的目標(biāo)群體。由于受客觀條件因素的影響，本研究未能探討多基因聚合育種技術(shù)應(yīng)用于選育中的效果，尚需進一步研究。

多基因聚合效果分析所用的7 個與體質(zhì)量顯著相關(guān)的標(biāo)記均為本實驗前期通過候選基因關(guān)聯(lián)分析方法篩選而獲得的，前期研究結(jié)果顯示，這7 個標(biāo)記的優(yōu)勢基因型個體的平均體質(zhì)量比其他基因型個體的平均體質(zhì)量高6.86%～11.00% (曹婷婷等, 2012a、b;樊佳佳等, 2014; 唐小紅, 2015)，其中，A+762G 標(biāo)記對體質(zhì)量影響作用最大，其優(yōu)勢基因型個體的平均體質(zhì)量比非優(yōu)勢基因型個體高11.00% (唐小紅, 2015)。在本研究的家系子代中，這7 個標(biāo)記的優(yōu)勢基因型個體的平均體質(zhì)量比非優(yōu)勢基因型個體提高了4.27%～12.11%，其中，A+762G 標(biāo)記的優(yōu)勢基因型個體與非優(yōu)勢基因型個體的平均體質(zhì)量差異最大，優(yōu)勢基因型個體的平均體質(zhì)量為162.41 g，比其余個體的平均體質(zhì)量提高了12.11%，本研究結(jié)果與前期的研究結(jié)果基本一致，均反映出A+762G 標(biāo)記對體質(zhì)量的影響作用最大。A+762G 標(biāo)記位于丙酮酸激酶1 型(PKL)基因上，PKL是糖酵解過程中最關(guān)鍵的催化酶，可催化PEP 轉(zhuǎn)化為丙酮酸，將高能磷酸鍵轉(zhuǎn)移給ADP生成ATP，從而參與機體生命活動及生長發(fā)育過程(戴超等, 2014)。在草魚基因聚合育種實踐中可考慮將PKL基因上A+762G 標(biāo)記作為首選目標(biāo)標(biāo)記。

本研究不同基因的組合效應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)，生長相關(guān)的優(yōu)勢基因型聚合數(shù)量越多，其生長性狀表型值越高，但具有4 個和3 個優(yōu)勢基因型的個體平均體質(zhì)量相差很小(1.24 g)，具有3 個和2 個優(yōu)勢基因型的個體平均體質(zhì)量相差也很小(2.2 g)。優(yōu)質(zhì)肉雞繁殖性能相關(guān)標(biāo)記的聚合基因型的效應(yīng)分析研究中也存在類似結(jié)果(張增榮等, 2013)。推測可能多基因聚合并不是單基因的基因型效應(yīng)的簡單相加，而是不同基因之間存在一定的相互作用，從而影響整個性狀的形成(李國輝等, 2010)。李紅霞等(2014)分析建鯉ODC1基因與增重相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，其主效SNP 標(biāo)記之間也存在拮抗或協(xié)同作用。李勝杰等(2019)研究大口黑鱸生長相關(guān)標(biāo)記的聚合效果也發(fā)現(xiàn)，基因之間存在互作效應(yīng)，進而影響其生長性狀。趙秀華(2012)對京海黃雞GFBP-1、IGFBP-2和STAT5基因進行三基因互作效應(yīng)分析，結(jié)果顯示，三基因聚合效應(yīng)＞二基因聚合效應(yīng)＞單個基因效應(yīng)，但組合基因效應(yīng)并非是單個基因型效應(yīng)的簡單累加。上述研究提示，今后的多基因聚合育種要將單基因效應(yīng)分析及不同基因的組合效應(yīng)分析相結(jié)合，選擇最優(yōu)秀和合理的多基因聚合式應(yīng)用于生產(chǎn)實踐中。